FLASH: The Fordham Law Archive of Scholarship and History
Abstract
Bu çalışmada, Gökkuşağı alabalıklarında enfeksiyonoluşturan Ichthyophthirius multifiliis’infarklı bölgelerden izole edilmiş saha suşlarının genotipik yapıları temelindeimmundominant özellik gösteren rekombinant immobilizan antijenlerini(i-antijen) kodlayan genlerin bakteriyel ekspresyon sistemine klonlanarakeksprese ve karakterize edilmeleri, antijenik profillerinin ortaya çıkarılmasıve aşı adayı olabilecek rekombinant antijenlerin elde edilmesi amaçlanmıştır. Çalışmada 2018 ve 2019 yıllarının Temmuz ve Ağustos ayları arasında Gökkuşağıalabalığı yetiştiriciliğinin yoğun yapıldığı Samsun, Rize, Kayseri, Elazığ,Burdur, Antalya ve Muğla illerinde bulunan işletmeler ziyaret edilerek balıkpopülasyonları üzerinde saha araştırmaları yürütülmüş ve I. multifiliis ile enfekte bulunan balıklardan ilgili protokolleregöre izolasyon gerçekleştirilmiştir. Laboratuvara uygun solüsyonlar ve soğukzincir altında intikal ettirilen örneklerden cDNA ve gDNA izolasyonlarıgerçekleştirilmiştir. I. multifiliis i-antijengen lokusunun amplifikasyonu amacıyla optimum primer dizaynı için ön çalışmalaryürütülmüş ve hedef gen bölgeleri uygun amplifikasyon koşullarında PCR’daçoğaltılmıştır. Elde edilen amplikonlar agaroz jel üzerinden saflaştırılmıştır.Multiple gen lokusu sekanslarının belirlenebilmesi amacıyla ilgili pürifiyeamplikonlar pJET 1.2 plazmit vektörüne CloneJET PCR cloning kit (Thermo FisherScientific) kullanılarak klonlanmış ve katı besi yerinde belirlenenkolonilerden rekombinant plazmid DNA izolasyonları gerçekleştirilmiştir. Rekombinantplazmidler spesifik primerlerle çift yönlü olarak sekanslanmış vekromotogramlar De Novo Assemble üzerinden işlenerek hedef insert sekanslarvektör plazmid DNA’sı içerisinden çıkarılmış ve konsensüs sekanslar eldeedilmiştir. İlgili primerlerin i-antijen gen lokusu içerisinde çoğalttığı fragmentlerinbelirlenebilmesi amacıyla PCR ürünleri ayrıca yeni nesil dizileme teknolojisi (NGS)kullanılarak işlenmiş ve elde edilen dizilimlerin gen veri tabanlarındakimevcut tüm i-antijen gen lokusları ile filogenetik ilişkileri araştırılmıştır.Tüm bu araştırmalar sonucu karakterize edilen i-antijen genlerinin ekspreseettiği proteinlerin rekombinant olarak eldesi için çalışmalargerçekleştirilmiştir. Aşı adayı potansiyeli olabilecek bazı lokusların bakteriyelekspresyon sistemine aktarımı için kodon optimizasyonları yapılarak pET-32a(+)ekspresyon plazmid DNA’sına (Novagen) klonlanması gerçekleştirilmiştir. Eldeedilen rekombinant plazmitler E. colikompotent BL21(DE3) hücrelerine transforme edilerek optimum koşullardaekspresyon çalışmaları yürütülmüş ve ekspresyon etkinliği SDS-PAGE ve WesternBlot analizleri ile belirlenmiştir. Eksprese edilen rekombinant i-antijenproteinleri afinite kromotografi kulanılarak saflaştırılmış ve immunreaktiflikleri Western Blot analizleri ile tespit edilmiştir. Çalışmada,Elazığ, Rize ve Muğla illerinde ziyaret edilen işletmelerdeki Gökkuşağıalabalıklarında deri ve solungaçlarından hazırlanan preparatların mikroskobikincelemeleri ile I. multifiliisenfeksiyonunun yaygın olduğu görülmüştür. İlgili bölgelerden elde edilen I. multifiliis suşlarına ait cDNA vegDNA izolatlarının i-antijen gen lokusunun dizayn edilen pirmerlerle PCR’daamplifiye edilmesi sonucu 1200-1300 bp büyüklüğünde amplikonlar saptanmıştır.Pürifiye amplikonların klonlanması sonucu ilgili izolatlara ait açık okumaçerçevesi (ORF) sekanslarının analizinde birbirleriyle %38,3-58,8 arasındafarklılık gösteren 4 farklı i-antijen izoformu tespit edilmiştir. Bu izoformlararasında bir antijenik lokusun (ImulTR1-iant) her üç ildeki alabalıkpopülasyonlarından izole edilen I.multifiliis suşlarında da var olduğu NGS analizlerinde görülmüştür.ImulTR1-iant ORF sekansı ayrıca Amerika Birleşik Devletleri’nde alabalıklardanizole edilmiş bir i-antijen izoformuyla %83,3 identiklik gösterirken, diğertespit edilen izoformlara ait sekansların GenBank veri tabanında mevcuti-antijen sekanslarından oldukça farklı olduğu belirlenmiştir. Araştırmadarekaombinant i-antijen eldesi için yaygın belirlenen ImulTR1-iant izolatıüzerinden analizler yürütülmüştür. Bu izoformu kodlayan gen bölgesinin 1263bpbüyüklüğünde olduğu ve ORF’nin 420 amino asitten teşekkül ettiğibelirlenmiştir. ORF amino asit sekanslarının in-slico analizlerde 42,552 kDabüyüklüğünde bir proteini eksprese ettiği, bu proteinin sitoplazmik olduğu vetransmembran bölge içermediği tespit edilmiştir. Ayrıca ilgili ORF sekansıiçerisinde uzunluğu 7-22aa arasında değişen 21 antijenik bölge olduğubelirlenmiştir. Kodon optimizasyonu yapılmış olan ImulTR1-iant izoformuna ait pET-32a(+)rekombinant plazmitinin E. colikompotent BL21(DE3) hücrelerine transformasyonu ve ekspresyonu sonrasındayapılan SDS-PAGE analizlerinde in-silico analiz sonuçlarına paralel olarakyaklaşık 43kDa’luk protein jel üzerinde görüntülenmiştir. İlgili rekombinantprotein afinite kromotografide HisTrap FF crude (GE Healthcare) kolonlarıkullanılarak saflaştırılmış ve pürifiye rekombinant antijenin immun-reaktifliğiWestern-Blot analizleriyle gösterilmiştir. ErciyesÜniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından TOA-2017-7742 kodnumarasıyla desteklenen bu çalışma ile Türkiye’de gökkuşağı alabalıklarındasorun oluşturan ve ekonomik kayıplara yol açan I. multifiliis suşlarına karşı biyoteknolojik aşı geliştirilmesinoktasında aşı adayı olabilecek immobilizan antijenler üzerine özgün veriler sağlanmıştır.Elde edilen aşı adayı rekombinant antijenlerin etkinliğini ortaya koymanoktasında laboratuvar ve saha şartlarında immunizasyon ve çelınç enfeksiyondenemeleri için yeni proje çalışmaları planlanmaktadır.</style
