Background and aims: Coeliac disease (CD) is a gluten-induced disorder, which is characterized by an autoimmune response against enzyme transglutaminase 2 (TG2). In CD, TG2-specific plasma cells secrete immunoglobulin (Ig) class A autoantibodies against TG2. These cells are assumed to develop from IgD and IgM positive B cells. The common development of B cells is suggested to occur in lymphoid follicles and is characterized by the expression of transcription factor Pax5 and activation-induced cytidine deaminase (AID). However, a recent hypothesis suggests that the development of TG2-specific B cells may occur at extra-follicular sites of the intestinal mucosa. The majority of CD-patient material consists of small intestine biopsies, which are devoid of lymphoid follicles, and therefore is insufficient for studying the B cell differentiation. However, there is an abundance of lymphoid tissues that contain lymphoid follicles in the duodenal bulb. The aim of this thesis was to investigate whether CD-patient TG2-specific B cells exist in lymphoid follicles or at extra-follicular sites using a uniquely large collection of duodenal bulb biopsies from CD-patients and healthy controls.
Methods: The first phase was to screen 211 Finnish and 268 Romanian duodenal bulb biopsies to identify specimens most likely to contain lymphoid tissues with lymphoid follicles, including isolated lymphoid follicles (ILFs) and Peyer’s patches (PPs). The second phase was to detect TG2-specific B cells using immunofluorescence staining. The staining protocol consisted of biotinylated recombinant TG2 at a dilution of 1:100 and co-localization using antibodies against IgA, IgD, IgM, AID, and Pax5.
Results: Out of all the 479 screened specimens, 14% contained structures resembling ILFs and 2.7% contained structures resembling PPs. The chosen primary antibody dilutions in the optimized immunofluorescence staining were 1:25 for IgD and IgM, 1:100 for AID, and 1:250 for Pax5. Four specimens from untreated CD-patients and three specimens from non-CD controls were chosen for the final staining. In CD-patients, a total of three TG2-IgA double positive cells, four TG2-IgD double positive cells, and four TG2-AID double positive cells were identified that were no part of any recognizable lymphoid tissue. No TG2-IgM or TG2-Pax5 double positive cells were detected in CD-patients. Single IgD, IgM, and Pax5 positive TG2-specific B cells were detected in two controls.
Conclusions: Single TG2-specific B cells expressing IgD or AID were identified that were no part of any recognizable lymphoid tissue structure in CD-patient duodenal bulb biopsies. Therefore, the results suggest that a low number of TG2-specific B cells may develop at extra-follicular sites in the duodenal bulb mucosa.
Tiivistelmä
Tutkimuksen tausta ja tavoitteet: Keliakia on gluteenin laukaisema sairaus, jolle on tyypillistä autoimmuunivaste transglutaminaasi 2 (TG2)-entsyymiä kohtaan. Keliakiassa TG2-spesifiset plasmasolut erittävät immunoglobuliiniluokan (Ig) A autovasta-aineita TG2:ta vastaan. Näiden solujen on esitetty saavan alkunsa IgD- ja IgM-positiivisista B-soluista. B-solujen on oletettu yleisesti kehittyvän imukeräsissä, jolle on tyypillistä Pax5-transkriptiotekijän ja aktivaatio-indusoidun sytidiinideaminaasin (AID) ilmentäminen. Tuoreen hypoteesin mukaan TG2-spesifisten B-solujen kehitys saattaa kuitenkin tapahtua imukerästen ulkopuolella suoliston limakalvolla. Suurin osa keliakiapotilasmateriaalista koostuu ohutsuolibiopsinäytteistä. Ne sisältävät vähän imukeräsiä, mikä ei mahdollista B-solujen kehityksen tutkimista. Imukeräsiä sisältävää imukudosta on kuitenkin runsaasti duodenaalisessa bulbuksessa. Työn tarkoituksena oli tutkia, onko keliakiapotilaiden TG2-spesifisiä B-soluja imukeräsissä vai niiden ulkopuolella ainutlaatuisen suuren, keliaakikoista ja terveistä kontrolleista kerätyn duodenaalisen bulbusbiopsinäytesarjan avulla.
Tutkimusmenetelmät: Ensimmäisessä vaiheessa käytiin läpi 211 suomalaista ja 268 romanialaista duodenaalista bulbusbiopsinäytettä, joista seulottiin imukudoksellisia imukeräsiä todennäköisimmin sisältävät näytteet, mukaan lukien eristetyt imukeräset (ILF) ja Peyerin levyt (PP). Toisessa vaiheessa TG2-spesifisiä B-soluja havainnointiin immunofluoresenssivärjäyksen avulla. Värjäysprotokollassa käytettiin biotinyloitua rekombinantti-TG2:ta laimennoksella 1:100 ja vasta-aineita IgA:ta, IgD:tä, IgM:ää, AID:tä ja Pax5:ttä vastaan kolokalisaation havaitsemiseksi.
Tutkimustulokset: Kaikista 479 seulotusta näytteestä 14 % sisälsi ILF-rakenteellista imukudosta ja 2,7 % PP-rakenteellista imukudosta. Immunofluoresenssivärjäyksen optimoinnissa primäärivasta-ainelaimennoksiksi valittiin 1:25 IgD:lle ja IgM:lle, 1:100 AID:lle ja 1:250 Pax5:lle. Lopulliseen värjäykseen valittiin neljä hoitamatonta keliaakikkonäytettä ja kolme kontrollinäytettä. Keliaakikoissa havaittiin yhteensä kolme TG2-IgA-, neljä TG2-IgD- ja neljä TG2-AID-tuplapositiivista solua, jotka eivät olleet osana mitään tunnistettavaa imukudosta. TG2-IgM- ja TG2-Pax5-tuplapositiivisia soluja ei havaittu keliaakikoissa. Kahdessa kontrollissa havaittiin yksittäisiä IgD-, IgM- ja Pax5-positiivisia, TG2-spesifisiä B-soluja.
Johtopäätökset: Keliakiapotilaiden duodenaalisista bulbusbiopsinäytteistä löydettiin yksittäisiä TG2-spesifisiä B-soluja, jotka ilmentivät IgD:tä tai AID:tä ja jotka eivät olleet osana mitään tunnistettavaa imukudosrakennetta. Tulosten mukaan duodenaalisen bulbuksen limakalvolla saattaa siis kehittyä pieni määrä TG2-spesifisiä soluja imukerästen ulkopuolella
