Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013Multidrug resistant Staphylococcus aureus (MRSA) are pathogens responsible for multiple infections, even in healthy individuals, worldwide, thus requiring urgent development of new chemotherapies and a better understanding of mechanisms underlying antibiotic resistance. One of the most important cellular components is the cell wall, a structure essential for cell survival, responsible for conferring shape to bacteria, with a key role in establishing cell-environment interactions. In this way, cell wall synthesis constitutes a major target for antibiotics, such β-lactams or glycopeptides. When cell wall damage is inflicted, bacteria activate what is called the cell wall stress stimulon (CWSS), a coordinated response of several genes, in which VraSR regulatory system plays a major role. This system, composed of a histidine kinase (VraS) and cognate response regulator (VraR), is responsible for sensing cell wall threats and triggering the adequate response. Stochastic fluctuations in genetic expression, also called genetic noise, are responsible for variability in isogenic populations, a phenomenon common to all genes. In this work, we aim to investigate whether the promoters of vraSR and pbp2, a gene upregulated by VraR, which codifies for a cell wall synthesis protein, exhibit an increase in their genetic expression heterogeneity, upon cell wall stimulon stress induction. Their expression was compared to the housekeeping gene pta, a gene not related with the CWSS, in the presence of β-lactam oxacillin and the aminoglycoside kanamycin, a protein synthesis antibiotic that is not expected to activate the CWSS. We concluded that there was variability at the single cell level in genetic expression of CWSS promoter, but this variability did not increase upon exposure to cell wall targeting antibiotics.Staphylococcus aureus é uma bactéria patogénica nosocomial, bastante versátil e com grande capacidade de adaptação. A sua evolução levou ao aparecimento de estirpes resistentes resistente à meticilina (conhecidos pela sigla inglesa MRSA), que são actualmente virtualmente resistentes a todos os antibióticos disponíveis e responsáveis por diversas infecções, mesmo em indivíduos saudáveis, a nível mundial. A elevada mortalidade associada a infecções causadas por S. aureus e as opções limitadas de terapias eficientes, evidenciam a importância de se encontrarem novas estratégias para o seu tratamento e a necessidade da compreensão dos mecanismos subjacentes à resistência a antibióticos, adquiridos por esta bactéria patogénica. Como tal, necessita de uma resposta urgente ao nível do desenvolvimento de novas vertentes na terapia de antibióticos e um melhor conhecimento dos mecanismos subjacentes à resistência a antibióticos. Um dos principais componentes da célula bacteriana é a parede celular, uma estrutura essencial, responsável por conferir a forma às bactérias, com um papel especialmente relevante na interacção da célula com o meio envolvente. Como consequência, a síntese da parede celular constitui, desde logo, um alvo prioritário dos antibióticos desenvolvidos, como os β-lactâmicos. Esta família de antibióticos tem como alvo um dos últimos passos da síntese da parede celular, efectuado pelas proteínas de ligação à penicilina (PBPs). Uma vez aciladas pelos β-lactâmicos, estas proteínas perdem a capacidade de fazer o crosslinking do peptidoglicano, o que leva à lise celular. Contudo, estirpes MRSA têm a capacidade de crescer na presença de elevadas concentrações de β-lactâmicos, uma vez que adquiriram uma proteína adicional (PBP2A). As bactérias estão constantemente em interacção com o meio externo. Para manter a integridade celular, respostas fisiológicas adaptativas foram sendo desenvolvidas pelos microorganismos, envolvendo a integração dos diversos estímulos ambientais, para desencadear a resposta adequada, sobretudo através de sistemas regulatórios. Quando é infligido algum dano à parede celular, as bactérias activam o que é conhecido como o stimulon do stress da parede celular (em inglês CWSS), uma resposta coordenada de vários genes. O CWSS permite que a bactéria possa lidar com o dano causado na parede celular, activando e reprimindo um conjunto vasto de genes. Entre os genes que são activados por este sistema encontram-se, nomeadamente, os responsáveis por codificar para proteínas envolvidas na síntese da parede celular. Para detectar os danos infligidos na parede celular, no caso de S. aureus o sistema proeminente é o sistema regulatório VraSR, homólogo do sistema LiaFSR em Bacillus subtilis. Este sistema regulatório desempenha um papel central no CWSS, uma vez que funciona como complexo de antena, capaz de detectar os danos na parede celular e processar a activação do CWSS. Este sistema é composto pela cinase de histidina (VraS) e pelo correspondente regulador de resposta (VraR), factor de transcrição responsável pela activação ou silenciamento de um conjunto vasto de genes, embora recentemente se tenha revelado a presença de um terceiro elemento VraT, responsável por influenciar a fosforilação e consequente activação de VraS. Considera-se actualmente que este sistema regulatório constitui, consequentemente, um sistema de três componentes. Todos os genes estão sujeitos a oscilações estocásticas na sua expressão. Isto significa que numa população bacteriana composta por indivíduos geneticamente iguais, cada célula será uma individualidade, considerando a variabilidade existente na expressão dos vários genes. A oscilação na expressão dos genes geradora desta variabilidade é também conhecida como ruído genético. Este ruído é o resultado de dois fenómenos: ruído extrínseco, derivado das flutuações na concentração, localização e estado de determinadas moléculas no output de um dado gene e o ruído intrínseco, que se refere à variação da expressão genética devida à aleatoriedade com que se processam as reacções químicas, mesmo se a população for composta por células isogénicas com concentrações e estados dos compostos celulares idênticos. Neste sentido, este ruído intrínseco é também chamado de estocasticidade inerente à expressão de determinado gene. Em determinados casos, o ruído genético pode potenciar o aparecimento de fenómenos como a bi-estabilidade, no qual uma população de células geneticamente idênticas bifurca em duas sub-populações coexistentes. Um dos exemplos mais evidentes é o aparecimento de uma sub-população de bactérias resistentes, também chamadas, neste caso, de persistentes, dentro de uma população bacteriana isogénica, quando na presença de antibióticos. . Neste trabalho, temos como objectivo investigar se os promotores dos genes pertencentes ao CWSS, vraSR e pbp2, um gene regulado pelo VraR, que codifica uma proteína envolvida na síntese da parede celular, exibem um aumento da variabilidade na expressão genética, depois da activação do stimulon do stress da parede celular. A sua expressão foi comparada à do gene housekeeping pta, um gene que não está envolvido nem relacionado com o CWSS, na presença do antibiótico β-lactâmico oxacilina e do aminoglicósido canamicina, um antibiótico que não activa o stimulon. O controlo pelo gene housekeeping permitiu avaliar se o comportamento dos promotores do CWSS, em termos de variabilidade, era ou não similar ao comportamento evidenciado pelos restantes genes da bactéria. O uso dos antibióticos oxacilina e canamicina permitiu testar esse comportamento em condições de activação do CWSS e em condições em que este sistema não era activado. A expressão dos diferentes promotores foi monitorizada pelo gene repórter gfp em duas estirpes MRSA (MW2 e COL) e uma MSSA (Newman). Tendo em consideração a existência das variações entre células, mesmo tratando-se de populações isogénicas, foi construído um outro conjunto de estirpes, nas quais fosse possível monitorizar a expressão do promotor housekeeping e do promotor do CWSS simultaneamente na mesma célula. Neste caso, o promotor housekeeping foi monitorizado pelo gene repórter mCherry. Este conjunto de estirpes permitiu validar e corroborar os dados obtidos com o outro conjunto. Concluímos que existe variabilidade na expressão genética dos promotores de genes do CWSS, mas que esta variabilidade não aumenta na presença de antibióticos que têm como alvo a síntese da parede, um comportamento registado quer em estirpes MRSA, quer na estirpe sensível MSSA. Por outro lado, colocámos de parte a possibilidade da existência do fenómeno da bi-estabilidade nos promotores do CWSS, uma vez que não houve um aumento consequente da variabilidade, nem a bifurcação em sub-populações. Continua indefinida a eventual existência de uma correlação entre os níveis de expressão dos promotores do CWSS e a rapidez com que são activados com a resistência aos antibióticos
