Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013Psd1 is a defensin, isolated from Pisum sativum seeds, previously shown to have a strong interaction with fungal-specific membrane components. Candida albicans is an important human pathogen, causing oral, genital and systemic opportunistic infections, which are especially relevant clinically in immunocompromised patients, such as HIV-infected individuals. We tested the effects of this antimicrobial peptide against three C. albicans strains, of which one was a mutant that lacked the capability to produce glucosylceramide. We compared Psd1 with the antifungal drugs amphotericin B and fluconazole, at the minimal inhibitory concentration (MIC) and at a 10-fold higher concentration. Using atomic force microscopy (AFM) imaging and force spectroscopy, we assessed morphological changes and alterations in membrane stiffness on C. albicans planktonic cells. To determine whether Psd1 has an apoptosis triggering effect in the pathogen, a flow cytometry analysis was performed on Psd1 treated cells, after staining with propidium iodide and annexin V conjugated to FITC. Our results show that, with increasing incubation times and Psd1 concentrations, there is an increased surface roughness with the appearance of membrane features, such as blebs, cell size alterations, loss of volume and leakage of cellular contents. Also, Psd1 causes a loss of stiffness in the cell membrane and increases the percentage of apoptotic cells. In a general way, Psd1 has less antifungal action against the mutant strain, leading to assign glucosylceramide as one of its molecular targets in C. albicans. We were able to study the action of Psd1 against a relevant fungal human pathogen, aiming at its possible use as a natural antimycotic agent.As defensinas são um dos maiores grupos de péptidos antimicrobianos (AMPs) e têm sido alvo de investigação intensiva nos últimos anos. Os AMPs são péptidos encontrados no sistema imunitário de eucariotas, que têm uma larga atividade antibacteriana, antifúngica, antiviral e também anticancerígena. Estes péptidos são uma possível alternativa aos antibióticos utilizados hoje em dia, que com o decorrer dos anos têm perdido eficácia e cujos microrganismos contra os quais são utilizados têm desenvolvido cada vez mais mecanismos de resistência. A Psd1 é uma defensina com propriedades antifúngicas isolada de sementes de Pisum sativum. Tem 46 resíduos de aminoácidos e uma estrutura secundária composta por uma hélice α e folhas β, estabilizada por quatro pontes persulfureto. Foi recentemente demonstrado que este péptido tem grande afinidade, com elevada especificidade, para membranas modelo enriquecidas em ergosterol, o principal esterol presente nas membranas de fungos, e glucosilceramida, o glicoesfingolípido mais comum em fungos. Contrariamente, não existe interação entre o péptido e membranas modelo enriquecidas em colesterol, que simulam células de mamífero, levando a uma toxicidade reduzida para células humanas. A ação antifúngica da Psd1 foi anteriormente testada contra diferentes fungos, tendo sido descoberto em estudos com Neurospora crassa que tem afinidade para uma proteína relacionada com o controlo do ciclo celular, a ciclina F. Ao se ligar à ciclina F, a Psd1 provoca uma paragem no ciclo celular, promovendo endorreduplicação e perturbando a migração nuclear. Foi também testada por outros autores a sua ação contra duas estirpes de Candida albicans, uma estirpe nativa (WT) e uma estirpe derivada da WT e mutante na glucosilceramida sintetase, tendo-se demonstrado que a Psd1 causa uma menor inibição no crescimento da estirpe mutante. Estes resultados demonstram que a ação antifúngica da Psd1 envolve uma elevada afinidade para componentes na membrana em C. albicans, como as glucosilceramidas. Candida albicans é um importante agente patogénico que causa infeções oportunistas orais, genitais e sistémicas em humanos, sendo especialmente relevante em pacientes imunocomprometidos, tais como indivíduos infetados com o vírus HIV. Este fungo normalmente existe como comensal na microflora gastrointestinal e nas mucosas bucal ou vaginal. Mais de 50% da população humana pode ser portadora de C. albicans como comensal sem ter qualquer efeito negativo. Contudo, este fungo pode alternar o seu estado de comensal para invasivo, dependendo de alguns fatores relacionados com o hospedeiro, tais como perturbação da microflora normal de algumas mucosas, imunossupressão ou disrupção de funções protetoras de barreiras como a pele. C. albicans possui vários fatores de virulência que possibilitam a sua patogenicidade. Estes incluem dimorfismo morfológico, expressão de adesinas e invasinas à superfície celular, tigmotropismo, formação de biofilmes, switching fenotípico, secreção de enzimas hidrolíticas e atributos relacionados com aptidão biológica, como resposta ao stress mediada por proteínas de choque térmico (HSPs) ou excreção de amónia para alcalinizar o ambiente extracelular. Em organismos unicelulares, a apoptose é um processo de morte celular programada que pode ser encarado como um processo em que a morte altruísta de algumas células pode ser benéfica para a população como um todo ao promover a sua sobrevivência. A apoptose é regulada por uma complexa rede de proteínas (caspases) e de processos metabólicos. Em fungos existe pelo menos um ortólogo das caspases de mamíferos: a metacaspase YCA1 (yeast caspase 1). Alguns efeitos que definem este processo incluem alterações proteómicas nas mitocôndrias, libertação de citocromo c no citosol, aumento de produção de espécies reativas de oxigénio, aparecimento de marcadores apoptóticos, tais como vesículas membranares, ou perda de volume celular. Testes de rotina para a deteção de caraterísticas apoptóticas são utilizados para a identificação de células que estejam a passar por um processo apoptótico após tratamento com agentes antifúngicos. Esta prática é comum quando se estudam os efeitos de péptidos antimicrobianos em C. albicans. Neste trabalho, testámos os efeitos da Psd1 em três estirpes de C. albicans, um isolado clínico e as duas estirpes referidas anteriormente, a WT e a mutante na glucosilceramida sintetase, para determinar se a ausência deste glicoesfingolípido interfere na ação da defensina, sob o ponto de vista biofísico e das características estudadas nesta tese. Comparámos a Psd1 com as drogas antifúngicas anfotericina B e fluconazol, um polieno e um azol, respetivamente. A anfotericina B é um composto que se liga irreversivelmente ao ergosterol presente na membrana celular de fungos, formando poros que levam à perda de conteúdos intracelulares e, posteriormente, à morte celular. O fluconazol necessita entrar dentro da célula para surtir o seu efeito, que consiste na perturbação da síntese de ergosterol, ao impedir que o seu percursor, lanosterol, seja desmetilado. Para as três estirpes de C. albicans foi determinada a concentração mínima inibitória (MIC) destes compostos com atividade antifúngica, que foram posteriormente testados à concentração correspondente à MIC e a uma concentração 10 vezes superior. Utilizando imagens de microscopia de força atómica (AFM) e espetroscopia de força baseada em AFM, avaliámos alterações na morfologia, tais como rugosidade da superfície da célula e perda de volume celular, e alterações biomecânicas de células plantónicas de C. albicans, ao nível da rigidez membranar. Para determinar se a Psd1 tem a capacidade de provocar apoptose neste agente patogénico, foi efetuada uma análise de citometria de fluxo em células tratadas com Psd1, após marcação com as sondas fluorescentes iodeto de propídeo e anexina conjugada a FITC. Os nossos resultados demonstram que, com o aumento de concentração e o tempo de incubação com Psd1, há um aumento da rugosidade da membrana celular, verificado pela visualização e pela análise de imagens de altura obtidas por AFM. Através de imagens de AFM obtidas em modo de erro, verificou-se também o aparecimento de caraterísticas associadas à apoptose, tais como vesículas membranares, alterações de tamanho e perdas de volume e de conteúdos celulares. Pôde-se também visualizar que as células parecem ter uma menor capacidade de adesão após tratamento com o péptido, o que pode indicar que a Psd1 tem a capacidade de interferir com a formação de biofilmes, visto que esta caraterística é determinante para a formação destes consórcios microbianos. Considerando as alterações morfológicas causadas pela defensina, o modelo que melhor explica o mecanismo de interação do péptido com a membrana é o modelo de carpete, com um efeito de detergente e micelização da membrana, em que há uma perturbação da organização e homogeneização membranar, sem a formação de poros na membrana. Pelos dados obtidos por espetroscopia de força baseada em AFM, foi calculado o módulo de Young, verificando-se uma diminuição da rigidez celular após tratamento com a defensina ou com qualquer dos outros compostos antifúngicos, o que também foi visualizado em imagens de AFM em modo de contraste de fase. Foi também possível determinar que a rigidez média das células de C. albicans mutante é intrinsecamente menor que a de células de C. albicans WT, o que está de acordo com o facto de as membranas ricas em ceramidas serem mais rígidas. Através de dados de citometria de fluxo, foi registado um aumento na percentagem de células apoptóticas. De um modo geral, a Psd1 tem menor ação antifúngica contra a estirpe mutante, indicando que a glucosilceramida possa ser um dos seus alvos moleculares em C. albicans. Foi assim possível adquirir um conhecimento mais alargado da ação da Psd1 contra um agente patogénico humano importante, apontando para o seu possível uso como um agente antimicótico de origem natural
