Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012Streptococcus pneumoniae is a common respiratory bacterial pathogen and a frequent cause of community-acquired pneumonia in developed countries. The genes encoding for the capsule polysaccharide (CPS), one of the most important virulence factors of these bacteria, are organized in an operon and in almost all the serotypes the two conserved Wzd and Wze proteins are expressed. Previous results suggest that if these two proteins cannot interact, forming a Wzd/Wze protein complex, pneumococcal bacteria will be prevented from producing capsule at the septum, which was shown to abolish the ability of these bacteria to cause bacteremia in mice after intranasal challenge. In this work, we aimed to find a method capable of screening and identifying small inhibitory (SI) peptides that prevent the interaction between Wzd and Wze. This could, consequently, represent a breakthrough in the development of strategies to replace vaccines against this important clinical pathogen. Initially, a derivative of the Escherichia coli bacterial two-hybrid assay was used. Here, T25- and T18-tagged proteins Wzd and Wze were expressed in the presence of a protein that should compete and interfere with their interaction. However, expression of this control protein, untagged and fully functional Wze, did not prevent the interaction between T25-Wzd and T18-Wze when expressed in a different plasmid. Afterwards we decided to screen for SI peptides directly in S. pneumoniae. For that purpose, we constructed a mutant strain that encodes in the chromosome both proteins, Wzd and Wze, functional and fused to different fluorescent proteins. Accordingly, we observed that Wzd and Wze were localized at the division septum of bacteria and that this localization was lost when a competitor was expressed from a replicative plasmid. We will now screen for SI peptides that can cause delocalization of Wzd and/or Wze and determine their effect on the synthesis of pneumococcal CPS.Streptococcus pneumoniae é um agente bacteriano patogénico que causa frequentemente pneumonia em paises desenvolvidos. Um dos factores de virulência mais importantes é a cápsula (CPS), um polissacarido que reveste as bactérias. Os genes que codificam para a síntese da cápsula encontram-se organizados num operão que contém os genes wzd e wze, conservados em quase todos os serotipos conhecidos. As proteínas Wzd e Wze interagem formando um complexo proteico que é recrutado para o septo, local de divisão da bactéria, induzindo e regulando a síntese da cápsula. Resultados anteriores sugerem que a inibição da ligação entre estas duas proteinas pode impedir a produção de CPS no septo. Por esta razão, a descoberta de pequenos péptidos, denominados de péptidos SI (pequenos péptidos inibitórios – small inibitory peptides), que inibam a interacção entre as proteínas Wzd e Wze, pode significar uma revolução na criação de estratégias alternativas para substituir as vacinas desenvolvidas contra este patogéneo. O objectivo deste trabalho consistiu no desenvolvimento de um método de identificação de péptidos SI. Começou-se por usar um derivado do sistema “bactérial twohybrid”, em Escherichia coli, em que ambas as proteínas Wzd e Wze, contendo os tags T25 e T18 respectivamente, são expressas na presença de uma proteína competidora capaz de inibir a interacção Wzd/Wze. Contudo, este método não se revelou o mais adequado. De seguida decidiu-se desenvolver um sistema alternativo que pudesse identificar péptidos SI directamente em pneumococos. Para isso, construiram-se mutantes que expressam no cromossoma os genes wzd e wze em fusão com sequências que codificam para diferentes proteínas fluorescentes CFP e Citrine, respectivamente. Esta ferramenta revelou-se capaz de identificar péptidos SI que inibam a interacção entre as proteínas Wzd e Wze. Posteriormente procuraremos outros péptidos SI capazes de deslocalizar as proteínas Wzd e/ou Wze e determinar o seu efeito na síntese de CPS de pneumococos
