Mestrado em BioquímicaBacterial resistance is a major issue in research related to environmental and public health, due to the ineffectiveness of antibiotics, resulting from a subpopulation of bacterial cells entering a dormant state. Multiple studies revealed that toxin-antitoxin systems are involved in such bacterial persistence. An example of such a toxin-antitoxin system is the HipAB complex, where HipA, and its cognate antitoxin are intimately related. HipB is very unstable and it is prone to degradation by proteases (e.g. Lon protease), leaving HipA exerting its toxic effect on cells. To study the conformations and interactions from HipAB in Shewanella oneidensis, it was necessary to overexpress and purify the proteins and to perform cross linking reactions which were analysed by mass spectrometry. The cross linking reactions were performed with BS3 (Bis[sulfosuccinimidyl] suberate), an in solution cross linker, tested at different concentrations (0.5mM, 1mM, 2mM) to find more efficient reaction conditions. By SDS-PAGE analysis it was possible to conclude that the best cross linker concentration is the highest tested. Furthermore, some predictions from possible intra- and intermolecular binding sites were made, unfortunately it was only possible to identify an interaction between HipA(143) and HipA(264).A resistência bacteriana é um ponto importante de estudo em investigação relacionado com o ambiente e a saúde pública, devido à ineficiência dos antibióticos, que resulta de uma subpopulação de células bacterianas que entram num chamado estado dormente. Diversos estudos indicam que os sistemas toxina-antitoxina estão envolvidos nessa persistência bacteriana. Um exemplo de um sistema toxina-antitoxina é o complexo HipAB, em que a HipA e a sua respetiva antitoxina estão intimamente relacionadas. HipB é muito instável e propenso à degradação por proteases (por exemplo: Lon protease), deixando a HipA a exercer o seu efeito tóxico nas células, Para estudar as conformações e interações da HipAB na Shewanella oneidensis, foi necessário sob expressar e purificar as proteínas e promover as reações de cross linking que foram analisadas por espectrometria de massa. A reações de cross linking foram realizadas usando o BS3 (Bis[sulfosuccinimidyl] suberate), um cross linker in solution, testado a diferentes concentrações (0.5mM, 1mM, 2mM) para encontrar as condições de reação mais eficientes. Pelas análises de SDS-PAGE foi possível concluir que a melhor concentração de cross linker foi a mais alta testada. Para além disso, foram feitas algumas previsões de possíveis sítios de ligação, intra- ou intermolecular, no entanto só foi possível identificar uma das interações entre a HipA(143) com a HipA(264)
