Tese de doutoramento, Biologia (Biologia Evolutiva), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013Hybridization is currently a well-recognized process amongst animals responsible for biodiversity, evolution and speciation processes while defying most species concepts. Hybridization is prevalent among fishes, particularly cyprinids, which therefore constitute good models of study (1) to access general patterns of genomic variation, (2) to identify the genetic basis and the evolutionary processes behind adaptation and speciation in the wild, (3) working at different levels, from genome-wide to large geographic ranges and multiple gradients of selection. Considering that hybrids are usually characterized by genome instability and restructuring, the aim of this dissertation was to understand some processes of genome dynamics while also characterizing natural homoploid hybrids between Achondrostoma oligolepis and either Pseudochondrostoma duriense or its sister-species P. polylepis, mainly by means of cytogenomics integrated with morphologic and genetic data sets. Molecular probes included ribosomal DNAs, whole genomic DNAs, highly-moderately repetitive DNA fraction (C0t-1 DNA), retroelement Rex3, and telomeric (TTAGGG)n repeats, used to characterize nine Iberian species of Chondrostoma s.l. and the aforementioned hybrids using FISH, CGH and GISH procedures. This investigation provided new data on independent hybrid zones helping to better understand these not-so-highly conservative karyotypes as previously considered, their differentiation within the subfamily Leuciscinae, the interacting genomes in the hybrid compositions, and their post-hybridization dynamics and rapid reorganization. But many questions, including new ones, remain unanswered, namely, hybrids’ fitness in different environments, meiotic behaviour of hybrid heterokaryotypes, modes of inheritance and dosage compensation of diverging loci from each parent; as well as continuing to refine karyotype differentiation against a virtually constant macrostructure in highly flexible genomes. In summary, the hybrid fish systems that occur in the Iberian Peninsula – homoploid or polyploid – are promising regarding unresolved questions related to genome composition, plasticity and dynamics, and to evolutionary relevant processes like hybridization, introgression, adaptation or speciation, amongst many other biologically relevant subjects.O processo de hibridação inter-específica é actualmente considerado também entre os animais como um promotor de biodiversidade, evolução e especiação, ao mesmo tempo que desafia a maioria dos conceitos de espécie mais reconhecidos. A hibridação é prevalente entre os peixes, particularmente os representantes da família Cyprinidae, que, assim, constituem bons modelos de estudo para (1) aceder aos padrões gerais de variabilidade genómica, (2) identificar a base genética e os processos evolutivos por detrás de adaptação e especiação naturais, (3) trabalhar a vários níveis, desde o genómico e citogenómico a vastas áreas geográficas e gradientes múltiplos de selecção. Tendo em conta que os híbridos são geralmente caracterizados por apresentarem sinais de instabilidade e de reestruturação genómica, o presente estudo pretendeu investigar estas questões com base na análise de híbridos homoploides entre Achondrostoma oligolepis e ou Pseudochondrostoma duriense ou a sus espécie-irmã P. polylepis, essencialmente através de técnicas de citogenética molecular, integradas com dados de morfologia e genética já descritos para as espécies parentais. O conjunto de sondas moleculares seleccionado incluiu DNAs ribossomais (rDNA), DNA genómico total, fracção de DNA altamente a moderadamente repetitivo (C0t-1 DNA), retroelemento Rex3, e repetições teloméricas (TTAGGG)n, as quais foram utilizadas em metodologias de hibridação in situ fluorescente (FISH), hibridação in situ genómica (GISH) e hibridação genómica comparativa (CGH).Inicialmente, nove espécies Ibéricas de Chondrostoma s.l., nomeadamente Achondrostoma arcasii, A. occidentale, A. oligolepis, Iberochondrostoma almacai, I. lemmingii, I. lusitanicum, Pseudochondrostoma duriense, P. polylepis e P. willkommii, foram caracterizadas para a distribuição das duas famílias de rDNA evidenciando uma variabilidade em número e localização de clusters superior ao que seria expectável tendo em conta a reconhecida uniformidade macroestrutural dos seus cariótipos e da subfamília (Leuciscinae) a que pertencem (Capítulo 2). Estes resultados apontavam já para um nível de diferenciação cariotípica, praticamente indetectável com técnicas de citogenética convencional e/ou de menor resolução. Numa destas espécies, melhor estudada em termos de genética populacional (i.e. I. lemmingii), foi possível traçar a história evolutiva dos genes de rDNA no seio do género a que pertence (Iberochondrostoma). Na fase seguinte deste estudo, e tendo já sido definidos marcadores específicos para cada uma das espécies parentais, procedeu-se à análise dos já mencionados híbridos naturais, amostrados em várias zonas híbridas independentes: Rio Sousa na bacia do Rio Douro, rios Caima e Serra na bacia do Rio Vouga, e rios Mortágua, Alva e Ceira na bacia do Mondego) (Capítulo 3). Neste capítulo foi evidenciada a importância da utilização de abordagens múltiplas no estudo de híbridos e de zonas híbridas naturais, especialmente em casos de retrocruzamento extensivo e recorrente, onde os híbridos rapidamente se confundem numa observação superficial com as espécies parentais. Esta abordagem integrativa permitiu identificar padrões genéticos não-puros em todos os peixes seleccionados como possíveis híbridos. Os resultados foram, regra geral, idênticos em ambos os sistemas híbridos estudados (i.e. A. oligolepis x P. duriense e A. oligolepis x P. polylepis), tendo sido possível comprovar a existência de processos de retrocruzamento preferencial com A. oligolepis. Assim, A. oligolepis pôde ser considerada a espécie parental com uma maior contribuição genética para a constituição dos genomas híbridos analisados, surgindo como uma espécie mais permissiva à introgressão do que as outras duas. Adicionalmente, a espécie A. oligolepis não só aparentou um maior envolvimento como também se revelou mais afectada pelos recorrentes eventos de hibridação, uma vez que só foram encontradas translocações cromossómicas óbvias em híbridos de tipo-A. oligolepis. Não obstante, os híbridos apresentaram um extenso polimorfismo de rDNA, aparentemente ausente nas espécies parentais, mas dentro das possíveis combinações entre as contribuições parentais, com excepção de alguns fenótipos transgressivos inexplicáveis à luz de uma recombinação normal dos genomas parentais. Estes resultados dão provas de uma evolução e reestruturação genómica rápida nos híbridos, provavelmente responsável pela disponibilização de combinações genéticas distintas que permitirão uma melhor adaptação face a novas adversidades ambientais ou genómicas. Um dos mecanismos que poderia explicar esta rápida reorganização do genoma nos híbridos seria a re-activação de elementos transponíveis. Para testar esta hipótese, procedeu-se ao mapeamento de um dos elementos transponíveis mais comum entre os teleósteos: Rex3 (Capítulo 3.2). Para identificar a existência de um eventual processo de reactivação de Rex3 nos híbridos, foi previamente analisada a distribuição deste elemento no genoma das espécies parentais, como ponto de comparação pré- e pós-hibridação. Assim, o mapeamento físico do Rex3 foi efectuado pela primeira vez em espécies de ciprinídeos, tendo sido incluídas as espécies Ibéricas Anaecypris hispanica, Iberochondrostoma lemmingii, I. lusitanicum, Pseudochondrostoma duriense, P. polylepis e híbridos de P. polylepis x A. oligolepis. Em paralelo foram também mapeadas outras sequências repetitivas para as quais se pretendia determinar a possibilidade de associação com este retroelemento. O mapeamento do Rex3 mostrou um padrão de acumulação preferencialmente centromérico-telomérico, correlacionando-se com regiões de heterocromatina constitutiva mas não com nenhum dos rDNAs. O padrão observado foi genericamente idêntico e comparável em todas as espécies testadas, sugerindo uma presença muito antiga e anterior ao respectivo processo de diferenciação. Nos híbridos, o padrão de distribuição de Rex3 foi essencialmente do mesmo tipo, embora presente em mais pares de cromossomas e claramente associado a clusters de rDNA, em particular clusters de 45S rDNA translocados (ver Capítulo 3.1). Estes resultados parecem evidenciar uma re-activação de mecanismos de transposição nos híbridos, surgindo portanto como uma das muitas consequências dos processos de hibridação inter-específica.A presente dissertação encontra-se estruturada em seis Capítulos e quatro Apêndices que, à excepção da Introdução (Capítulo 1), Discussão (Capítulo 5) e Considerações Finais incluindo novas perspectivas de estudo (Capítulo 6), resultam da compilação de publicações científicas em revistas internacionais indexadas (Capítulos 2 a 4). Em Apêndice foram compilados todos os dados de morfologia resultantes desta investigação (Apêndice I) e três publicações da co-autoria da autora desta dissertação (Apêndices II a IV) que, não sendo parte essencial deste trabalho, foram consideradas de interesse como complemento a alguns dos aspectos discutidos no Capítulo 5. No Capítulo 1 são abrangidos os temas chave fundamentais para a integração dos capítulos seguintes. No Capítulo 2 faz-se a caracterização das espécies parentais envolvidas nos dois sistemas híbridos abordados neste trabalho, Achondrostoma oligolepis, Pseudochondrostoma duriense e P. polylepis, dentre outras seis espécies Ibéricas que ocorrem em território nacional (nomeadamente, A. arcasii, A. occidentale, Iberochondrostoma almacai, I. lemmingii, I. lusitanicum e P. willkommii). O Capítulo 3 trata da caracterização dos mencionados híbridos homoploides, tendo como base de comparação as espécies parentais previamente caracterizadas. Pela primeira vez, estes híbridos foram abordados de um modo multidisciplinar, combinando marcadores morfológicos, genéticos e citogenómicos. No Capítulo 4 faz-se uma síntese dos avanços na citogenética de peixes, com particular ênfase para os leuciscíneos da Península Ibérica e para os híbridos homoploides. Esta investigação providenciou novos dados relativamente a zonas híbridas independentes, ajudando a ilustrar: (1) que os cariótipos das espécies-alvo não são tão conservados como se pensavam com base em estudos anteriores de nível macroestrutural; (2) a sua diferenciação ao nível da subfamília; (3) a interacção de genomas divergentes nas várias composições híbridas analisadas; e (4) a sua dinâmica e rápida reorganização após eventos recorrentes de hibridação. Contudo, várias questões permanecem ainda sem resposta, nomeadamente, acerca da fitness das várias composições híbridas em diferentes ambientes, do comportamento meiótico dos heterocariótipos híbridos, dos modos de hereditariedade e de compensação de dosagem de loci parentais divergentes. Em conclusão, os sistemas de peixes híbridos endémicos da Península Ibérica – homoploides e poliploides – podem ser considerados bons modelos para estudos de composição, plasticidade e dinâmica genómica, assim como de processos de relevância evolutiva como a hibridação, a adaptação ou a especiação, entre muitos outros.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/44980/2008, projeto PEst-OE/BIA/UI0329/2011); Institute of Animal Physiology e Genetics, Academy of Sciences of the (Czech Science Foundation grant No. 13-37277S
