La Sclerosi multipla (SM) è una patologia infiammatoria cronica del sistema nervoso centrale (SNC), caratterizzata da una progressiva perdita della guaina mielinica, la quale garantisce un’adeguata trasmissione dell’impulso nervoso tramite il rivestimento degli assoni . La patologia risulta caratterizzata dalla presenza, a livello del SNC, di placche “sclerotiche”, come conseguenza del rilascio di molecole pro-infiammatorie che vanno ad attaccare la guaina mielinica, così come le cellule deputate alla loro produzione, gli oligodendrociti. Quest’ultime sono cellule mature derivanti da precursori gliali indifferenziati, i precursori degli oligodendrociti (OPC), che si ritrovano a livello del SNC umano dalla nascita. Questi precursori vanno incontro ad un preciso programma di proliferazione, migrazione, differenziazione e mielinizzazione, per produrre infine la guaina isolante degli assoni. Lo sviluppo degli oligodendrociti in vitro progredisce attraverso stadi distinti, caratterizzati da una combinazione molto dinamica di fattori di trascrizione e specifici fenotipi antigenici.
Tra i numerosi fattori implicati nel processo di mielinizzazione ritroviamo il GPR17. Il GPR17 è un recettore accoppiato a proteine G (GPCR), prevalentemente di tipo inibitorio; si tratta di un recettore dualistico, che risponde a due famiglie distinte di ligandi: i nucleotidi uridinici (UDP, UDP-glucosio), e cisteinil-leucotrieni (LTD4, LTC4, LTE4), con affinità rispettivamente nell’ordine del micromolare e del nanomolare.
Durante il differenziamento degli OPC, l’espressione del GPR17 segue una finestra spazio-temporale molto precisa: è ristretta agli stadi iniziali di maturazione mentre risulta nulla negli oligodendrociti maturi. È stato, inoltre, evidenziato che una forzata espressione del recettore negli OPC comporta un rallentamento della maturazione, e di conseguenza un blocco della produzione di mielina, portando a morte degli oligodendrociti. Il coinvolgimento del GPR17 nella SM viene confermato dalla presenza di un up-regulation recettoriale a livello delle placche sclerotiche.
Tenendo conto di questi dati, è stato ipotizzato che, al fine di una completa maturazione degli OPC, sia necessario uno spegnimento del recettore GPR17, attraverso un opportuno meccanismo di desensitizzazione, internalizzazione e down–regulation.
La desensitizzazione di un GPCR, ovvero la perdita di funzionalità recettoriale, in seguito alla prolungata esposizione ad un agonista, prevede di norma, come primo step, una fosforilazione del recettore su residui di serina e treonina, da parte di chinasi specifiche, denominate GRK, dopo associazione delle stesse al recettore; questo determina un aumento di affinità del recettore verso la proteina citoplasmatica β-arrestina, la quale ne promuove il distacco dalla proteina G e la sua internalizzazione in endosomi.
Questo lavoro di tesi si prefigge di indagare i meccanismi di regolazione del recettore GPR17 durante la maturazione degli OPC, ed in particolare il ruolo di specifiche GRK in tale processo. Tra i vari sottotipi delle GRK (classificate da 1 a 6), il focus si è rivolto verso la GRK2 e la GRK5. I livelli di GRK2 sono stati, infatti, ritrovati significativamente ridotti proprio in pazienti affetti da SM, mentre la GRK5 risulta funzionalmente alterata in patologie infiammatorie croniche. Da qui l’ipotesi di un loro possibile coinvolgimento nella regolazione funzionale del GPR17 negli OPC.
Gli OPC sono stati isolati da colture gliali della corteccia di ratto, quindi differenziati e raccolti a diversi stadi di differenziamento. Attraverso analisi Real Time PCR è stato confermato l’andamento di espressione del trascritto del GPR17 durante il differenziamento; dagli stessi esperimenti è inoltre risultato che le GRK 2 e 5 presentano un livello basale (negli OPC non differenziati) più alto del GPR17, ma la loro espressione ha un andamento molto simile a quello del recettore, raggiungendo un picco nei pre-oligodendrociti, per poi diminuire negli oligodendrociti maturi.
Abbiamo poi verificato, se, in seguito a stimolazione del GPR17 con i suoi agonisti, ci fosse fosforilazione del recettore. I risultati ottenuti attraverso un saggio di co-immunoprecipitazione e immunoblotting hanno evidenziato che, dopo trattamento dei pre-oligodendrociti per 5 min con UDP-glucosio o con LTD4, il GPR17 risulta fosforilato su residui di treonina, e , in misura minore, su quelli di serina.
Per indagare il coinvolgimento delle singole GRK nel processo di fosforilazione, abbiamo valutato l’associazione tra il recettore e le due chinasi. Da saggi di co-immunoprecipitazione è risultato che la GRK5 si associa fisicamente con il GPR17 preferenzialmente quando questo è stimolato da UDP-glucosio; al contrario in seguito alla stimolazione con LTD4, l’associazione del recettore avviene con entrambe le GRK, anche se in misura preferenziale con la GRK2.
La funzionalità del GPR17 è stata poi indagata valutando le sue cinetiche di desensitizzazione, mediante saggi funzionali di cAMP. Gli OPC sono stati pre-trattati con alte concentrazioni di UDP-glucosio e LTD4 per vari tempi, lavati, e stimolati nuovamente con gli agonisti in presenza di forskolina. Il saggio è stato effettuato sia al picco massimo di espressione del GPR17, sia allo stadio nel quale l’espressione del recettore tende a diminuire. Nel primo caso, si è osservato che entrambi gli agonisti, leucotrienici e nucleotidici, promuovono una desensitizzazione omologa del recettore con andamento tempo-dipendente. La cinetica di desensitizzazione appare più veloce quando indotta dall’agonista leucotrienico. Nei pre-oligodendrociti maturi, invece, il fenomeno di desensitizzazione è risultato appena significativo solo dopo 2 ore di pre-trattamento con l’agonista uridinico o leucotreinico. Questi risultati sono in linea con una diminuizione d’espressione delle GRK in questo stadio di maturazione degli OPC.
Infine, abbiamo verificato il ruolo della GRK2 nel meccanismo di desensitizzazione del recettore mediante l’uso di un’inibitore specifico per tale chinasi.
L’utilizzo dell’inibitore GRK2 ha bloccato la desensitizzazione del GPR17 indotta dall’agonista leucotrienico, mentre non ha mostrato effetto in seguito a stimolazione con l’agonista uridinico. Questi dati dimostrano che, analogamente a quanto dimostrato in precedenza in cellule transfettate, anche in cellule primarie la GRK2 ha un ruolo cruciale nella desensitizzazione del sito leucotrienico del GPR17. Al momento sono in corso studi per valutare la GRK implicata nella regolazione del sito purinergico.
In conclusione, i risultati ottenuti dimostrano che negli OPC il recettore GPR17, in seguito a stimolo con UDP-glucosio o LTD4, va incontro a fosforilazione, su residui di serina e treonina, e a desensitizzazione tempo-dipendente. Tale fenomeno sembra coinvolgere principalmente la GRK2 per quanto riguarda il sito leucotrienico: LTD4 induce, infatti, l’associazione preferenziale del recettore con la tale chinasi, e media desensitizzazione solo in presenza di GRK2 funzionalmente attiva. Dati preliminari suggeriscono invece che il ligando purinergico induca desensitizzazione recettoriale attraverso la GRK5. Tali risultati dimostrano che lo stesso recettore, attivato da classi di ligandi chimicamente diversi tra loro, può seguire vie intracellulari diverse. I dati risultano utili nella comprensione della regolazione del GPR17 durante la mielinizzazione degli OPC
