Tese de doutoramento em Biologia, na especialidade de Biologia Celular, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbr

Pereira, Sandro Lino Cardoso

Tese de doutoramento em Biologia, na especialidade de Biologia Celular, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.The potential application of stem cells as practical in vitro models for toxicological and pharmacological studies, or their prospective use in
regenerative medicine converts them in a powerful instrument for the
development of efficient therapies directed to a large array of pathologies.
Responding to the active demand to obtain the necessary knowledge to explore
this unique biological resource, a large body of literature has accumulated. This
has resulted in a better understanding of some of the mechanisms that regulate
stem cell properties, acting predominantly at the genetic, epigenetic or
transcriptional levels. However, an often-disregarded element without which the
physiology of stem cells cannot be truly comprehended is the cell metabolism. In
this context relatively few works show that in order to support cell function
metabolism must be appropriately regulated during different cell processes, such
as stem cell self-renewal, proliferation and differentiation. This metabolic
adaptation is a meeting point between stem and cancer founding cells, as these
present a common metabolic phenotype characteristic of actively proliferating
cells. Albeit not widely explored some evidences suggest that metabolism is
fundamental for stem cell identity, establishing a bidirectional regulatory
dialogue with the genetic processes.
T
The topic of the present dissertation is therefore the study of metabolic
involvement in cell differentiation in two distinct biological models. We
hypothesize that metabolic remodeling must accompany the process of cell
differentiation.
We first focused on the characterization of metabolic remodeling inherent to the
differentiation of a rat myoblast cell line profusely used as a model in
toxicological studies, the H9c2 cell line. The parental undifferentiated myoblasts,
which have a characteristically high proliferation rate, were induced to
differentiate towards skeletal muscle-like or cardiomyocytes-like cells, with
restricted proliferation. The comparative study of the metabolic profiles from
these three distinct populations was based on nuclear magnetic resonance and
convincingly confirmed that a marked metabolic shift accompanied the cell
specification process. The differentiating cells employed a more energy-efficient
metabolism associated with higher mitochondrial oxygen consumption whereas
the undifferentiated cells present a higher reliance on glycolysis. Importantly, we
have demonstrated that the parental cells have relatively increased anaplerosis in
the Krebs cycle and the differentiated cells present a better coupling between
glycolysis and the mitochondrial oxidative machinery.
In the second part of the thesis, our approach was to evaluate the effects of an
active metabolic modulation during neuronal differentiation of mouse embryonic
stem cells (mESC). Here, we demonstrated that the inhibition of the normal
mitochondrial electron transport chain activity, particularly due to the
application of Antimycin A (AA; a specific inhibitor of mitochondrial complex
III), translates into a lower differentiation efficiency. Remarkably, AA treatment
was able to maintain pluripotency marker expression on colonies grown for
prolonged periods under differentiation-inducing conditions. AA affected
distinct population of cells with different maturation states differently.
Specifically for mESC, AA did not cause apoptosis but did alter the cell cycle
with implications in terms of the proliferation rates. Lastly, we demonstrate that
AA treatment stabilized the hypoxia inducible factor HIF-1α in mESC grown in
normoxic conditions. HIF-1α is acknowledged to work as an inducer of a
metabolic shift favoring increased glycolysis, namely in cancer cells, thus
contributing to the Warburg effect, and might be an influential factor for
pluripotency maintenance acting downstream of AA in our model.
In sum the results presented in this relevant scientific thesis add substance to the
notion that a metabolic remodeling is a central element during cell
differentiation. The concretization of the stem cell therapeutic potential is
intimately dependent on our ability to tame stem cells and efficiently control
their properties such as pluripotency, self-renewal and specific differentiation.
Our results further contribute to the understanding of metabolism as a credible
substrate for modulating stem cell properties, and therefore identify metabolism
as an instrumental factor for the attainment of the stem cells promise.A aplicação de células estaminais tanto num contexto clínico como em
modelos toxicológicos é perspectivada como potencial ferramenta para o
desenvolvimento de terapias dirigidas a uma grande variedade de estados
patológicos. Consequentemente, um significativo corpo de trabalho tem-se
avolumado na tentativa de aprofundar o conhecimento que possa sustentar a
exploração deste recurso biológico. Este crescente esforço de investigação tem
resultado numa melhor compreensão de mecanismos que actuando a um nível
preponderantemente genético, epigenético e transcricional sustentam as
características únicas das células estaminais. Contudo, a fisiologia destas células
não poderá ser totalmente compreendida se não se atender à dinâmica
metabólica que a acompanha. Neste âmbito alguns trabalhos demonstram que o
metabolismo terá de ser correctamente regulado tanto no processo de
autorenovação e proliferação como durante o processo de diferenciação e
especialização celular, de modo a adequar-se à função e manutenção da própria
célula. Aqui reside um ponto de convergência entre as células estaminais
pluripotentes num estado indiferenciado e as células fundadoras de tumores,
edificando no seu conjunto um fenótipo metabólico característico de células com
grande capacidade proliferativa. Apesar de relativamente pouco explorado,
estudos recentes demonstram que o metabolismo concorre para a própria
A
identidade das células estaminais, estabelecendo uma relação bidireccional de
regulação com os processos genéticos.
Neste âmbito a presente dissertação trata o envolvimento do metabolismo no
processo de diferenciação celular. Numa primeira instância visamos a
caracterização da reprogramação metabólica inerente ao processo de
diferenciação de um modelo mioblástico de rato, amplamente empregue em
estudos toxicológicos, a linha celular H9c2. Estes mioblastos indiferenciados,
caracterizados por uma grande taxa proliferativa, foram induzidos a diferenciar
em células semelhantes a cardiomiócitos ou células musculares esqueléticas com
menor proliferação. O estudo comparativo do perfil metabólico destas três
populações baseado em ressonância magnética nuclear demonstrou que o
processo de especificação celular é acompanhado por uma alteração coesa do
metabolismo visando um aumento de eficiência dos processos energéticos.
Assim, verificamos que o estado de indiferenciação celular corresponde a uma
situação fisiológica mais dependente da via glicolítica e as populações
diferenciadas apresentam uma actividade mitocondrial mais elevada,
nomeadamente denotando um maior consumo de oxigénio. Será importante
referir ainda que verificamos um maior acoplamento entre a via glicolítica e a
actividade mitocondrial nas células diferenciadas e uma maior incidência de
actividade anaplerótica no ciclo de Krebs nas células indiferenciadas.
Na segunda parte deste trabalho abordamos os efeitos da modelação da
actividade da mitocôndria durante a diferenciação neuronal de células
estaminais embrionárias (pluripotentes) de ratinho. Demonstramos que a
inibição da actividade mitocondrial subsequente à aplicação de um inibidor
específico para o complexo III da cadeia respiratória (Antimicina A) traduz-se
numa menor eficiência de diferenciação e curiosamente no aumento da
percentagem de colónias positivas para marcadores de pluripotência, mesmo em
condições indutoras à diferenciação celular. Esta inibição afectou de modo
distinto diferentes populações correspondentes a diferentes fases de maturação
celular, sendo que ao nível das células estaminais embrionárias não detectamos
um incremento de apoptose, mas discernimos alterações no seu ciclo celular com
consequente incidência nas dinâmicas de proliferação. Por fim, demonstramos
que a aplicação de Antimicina A em células estaminais embrionárias leva a uma
estabilização em condições de normoxia do factor induzido por hipoxia HIF-1α,
sobejamente reconhecido como indutor de metabolismo glicolítico e que poderá
ser um dos factores a contribuir para os efeitos de manutenção de pluripotência
nas células estaminais embrionárias.
No seu conjunto os resultados desta dissertação vêm comprovar que o
metabolismo é um factor preponderante durante o processo de diferenciação
celular. A realização do potencial terapêutico das células estaminais esta
intimamente dependente da nossa capacidade de controlarmos as suas
características e processos celulares como pluripotência, autorenovação e
diferenciação específica. Os nossos resultados contribuem ainda para a
compreensão do metabolismo como substrato plausível para modelação dessas
características, sendo portanto um factor que acreditamos instrumental para a
eficaz concretização dos potenciais benefícios das células estaminais

A Metabolic Switch for Cell Differentiation

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