Tese de doutoramento em Ciências da Saúde (Ciências Biomédicas), apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de CoimbraParkinson’s disease (PD) is the second most prevalent neurodegenerative disorder
affecting almost 2% of people over 65 years of age. The primary neuropathological
hallmark of PD is the degeneration of the nigrostriatal dopaminergic pathway which, by
depleting dopamine in the brain, initiates abnormal motor symptoms including resting
tremor, bradykinesia, postural instability, gait difficulty and rigidity. A second relevant
hallmark is the presence of intracellular inclusion bodies, known as Lewy bodies that
mainly contain aggregated α-synuclein.
While the etiology involved in the development of PD is unknown, 90-95% of PD
cases occurs sporadically and correlates, in part, with mitochondrial dysfunction and
oxidative stress. Furthermore, the identification of single genes associated to the familial
forms of PD has revolutionized this field of research, providing unique opportunities to
pursue novel mechanisms and clues to the pathogenesis of PD. The sustained study of
the cellular functions of each PD-related gene indicates that protein misfolding and
aggregation, as well as, dysfunction of their quality control systems may play a crucial
role in the cascade of deleterious events implicated in the neurodegenerative process of
PD. Thus, clear insights into how mitochondrial dysfunction, oxidative stress and protein
homeostasis systems interconnect, overlap or converge to produce nigral neuronal
degeneration is essential to understand the pathogenesis of sporadic PD (sPD).
In this thesis, we initially addressed the potential implications of an altered
structural and functional crosstalk between mitochondria and the endoplasmic reticulum
(ER), two important metabolic organelles for the maintenance of cellular protein
homeostasis. We reported that mitochondrial dysfunction induced by an acute stimulus
of the neurotoxin MPP+ renders cells more susceptible to develop an ER stress
response. We found that MPP+ was able to evoke a sustained flux of Ca2+ from the ER to
mitochondria which subsequently triggered ER- and mitochondria-dependent apoptotic
pathways. Our findings highlight the inevitable role of ER to mitochondria Ca2+ fluxes and
their requirement for a mitochondria-dependent cell death induction, enclosing a
feedback loop whereas mitochondria signals ER and ER induces further mitochondrial
alterations, leading to the activation of cascade of signals that culminates in apoptotic
cell death.
Furthermore, we also found that ER stress response strengthens mitochondrial
stress-induced abnormalities. We demonstrated that sustained ER stress caused by
accumulation of unfolded or misfolded proteins potentiated Ca2+ overload and impairment of mitochondrial function mainly characterized by dissipation of mitochondrial membrane
potential and substantial decline in the mitochondrial respiratory chain complex I activity.
These cumulative events led to induction of apoptotic cell death.
In addition, we assessed the role of mitochondrial metabolism in the regulation of
the autophagy-lysosomal pathway, a major cellular homeostatic process that mediates
the degradation of long-lived proteins and dysfunctional or superfluous organelles in
eukaryotic cells. We demonstrated that prolonged metabolic failure due to mitochondrial
dysfunction, either in cellular models harboring sPD subjects mtDNA (sPD cybrids), cells
depleted of all mtDNA (Rho0 cells), or in MPP+-treated rat cortical neurons causes a
functional decline in the activity of the autophagic system. This defect is a consequence
of alterations in microtubules (MT) assembly that hamper mitochondria and
autophagosome transport along the MT network toward the lysosomal compartment.
Consequently, deficient autophagic turnover potentiates the accumulation of α-synuclein
oligomers and, ultimately, prompts apoptosis. Our data identify for the first time the PDassociated
defects in mitochondrial dysfunction as the basis for the selective transport
abnormalities and highly characteristic pattern of neuritic dystrophy associated to the
autophagic pathology in PD.
Finally, we dissected the molecular mechanisms by which mitochondrial
metabolism in sPD can affect MT-directed autophagic turnover that, in turn, regulates
intracellular protein homeostasis. We demonstrated that sirtuin 2 (SIRT2), a NAD+
dependent protein deacetylase, controls the functional ability of the autophagic system
by modulating the acetylation status of the MT cytoskeleton.
The studies presented here provide novel insights into the multiple mechanisms
that dictate the association between mitochondria, intracellular metabolism and
proteotoxicity in sPD, and contribute with new findings that could have important
therapeutic implications to halt or retard the progression of sPD pathology.A doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais comum,
afectando cerca de 2% dos indivíduos com idade superior a 65 anos. A marca
neuropatológica primária desta doença é a disfunção da via dopaminérgica
nigroestriatal, da qual resulta a depleção de dopamina no cérebro, conduzindo aos
principais sintomas motores que caracterizam a clínica da doença e que incluem tremor
de repouso, bradicinesia, instabilidade postural e rigidez muscular. Outra característica
neuropatológica da DP é a presença de corpos de inclusão intracelulares, designados
de Corpos de Lewy, que são maioritariamente constituídos por α-synucleína na forma
agregada.
Embora a etiologia da doença permaneça por esclarecer, sabe-se que 90-95%
dos casos de DP ocorrem de uma forma esporádica e pensa-se que, em parte, se
correlacionam com a disfunção da mitocôndria e com o stresse oxidativo. A identificação
de genes associados às formas familiares da DP revolucionou a forma de pensar dos
investigadores da área, proporcionando oportunidades únicas para estudar novos
mecanismos envolvidos na etiopatogenia da DP. O estudo continuado das funções
celulares de cada um dos genes relacionados com a DP indica que o misfolding e a
agregação proteica, bem como a disfunção dos sistemas de controlo de qualidade
proteica, desempenham um papel crucial na cascata de eventos implicada no processo
de neurodegeneração da DP. Assim, uma visão clara de como e quando a disfunção
mitocondrial, o stresse oxidativo e os mecanismos de homeostase proteica se
entrecruzam, sobrepõem ou convergem para produzir degeneração nigorestriatal é
essencial para a compreensão da fisiopatologia da DP do tipo esporádico (sDP).
Nesta tese, abordámos, inicialmente, as potenciais implicações das alterações na
interação estrutural e funcional entre a mitocôndria e o retículo endoplasmático (RE),
dois organelos importantes envolvidos na manutenção da homeostase proteica celular.
Reportamos que a disfunção mitocondrial induzida por um estímulo agudo da
neurotoxina MPP+ aumenta a susceptibilidade das células para o desenvolvimento de
uma resposta ao stresse do RE. Verificámos que o MPP+ foi capaz de evocar um fluxo
contínuo de Ca2+ entre o RE e a mitocôndria, desencadeando, subsequentemente, a
activação de vias apoptóticas dependentes do RE e da mitocôndria. Os resultados
obtidos destacam o papel inevitável dos fluxos de Ca2+ entre o RE e a mitocôndria, e a
sua relevância para a indução de morte celular dependente da mitocôndria,
estabelecendo-se um ciclo de retrocontrolo em que a mitocôndria sinaliza o RE e o RE induz alterações posteriores na mitocôndria, conduzindo à activação de uma cascata de
sinalização que culmina na morte celular por apoptose.
Do mesmo modo, observámos que o stresse do RE potencia alterações ao nível
da função mitocôndrial. Demonstramos que stresse do RE prolongado devido à
acumulação de proteínas mal processadas no seu interior conduz a um fluxo excessivo
de Ca2+ para o interior mitocôndria e a um comprometimento da função mitocondrial,
caracterizada principalmente pela dissipação do potencial de membrana e por um
decréscimo substancial da actividade da cadeia respiratória mitocondrial.
Cumulativamente, estes eventos desencadeam a indução de morte celular por
apoptose.
Por outro lado, avaliámos o papel do metabolismo mitocondrial na regulação da
via autofágica-lisossomal, um processo homeostático celular que medeia a degradação
de proteínas de longa duração e organelos disfuncionais em células eucarióticas.
Demonstramos que uma falência metabólica prolongada devido a disfunção mitocondrial
quer em células híbridas portadoras de ADN mitocondrial de doentes de sDP (cíbridos
sDP), em células depletadas do seu ADN mitocondrial (células Rho0) ou em culturas
primárias de neurónios corticais de rato tratados com MPP+, provoca um declínio
funcional na actividade do sistema autofágico. Este defeito é uma consequência de
alterações estruturais na rede microtubular (MT), comprometendo o transporte de
mitocôndrias e autofagossomas para o compartimento lisossomal, onde ocorre
degradação. Consequentemente, um ineficaz turnover autofágico potencia a
acumulação de oligómeros de α-sinucleína e, em última análise, desencadeia apoptose.
Assim, os dados obtidos identificam pela primeira vez os defeitos na função mitocondrial
associados à DP como a base para alterações específicas no transporte intracelular e
no padrão característico da distrofia neurítica associado à patologia autofágica na DP.
Por fim, analisámos os mecanismos moleculares através dos quais o metabolismo
mitocondrial em sDP pode afectar o turnover autofágico dependente da rede MT, o qual,
por sua vez, regula a homeostase proteica intracelular. Demonstramos que a sirtuina 2
(SIRT2), uma desacetilase citoplasmática dependente do NAD+, controla a capacidade
funcional do sistema autofágico, modulando o estado de acetilação do MTs.
Os estudos apresentados fornecem novas pistas relativamente aos múltiplos
mecanismos que determinam a associação entre mitocôndria, metabolismo intracelular
e proteotoxicidade e contribuem com novas perspectivas que poderão ter importantes
implicações terapêuticas no sentido impedir ou retardar a progressão da sPD.O trabalho apresentado nesta tese foi financiado pelo projecto PTDC/SAUNEU/102710/2008 concedido à Professora Doutora Sandra Morais Cardoso pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT-MEC, Portugal). A autora usufruiu de uma
bolsa de Doutoramento (SFRHD/BD/38743/2007) concedida pela FCT-MEC, Portuga