Tese de doutoramento em Biologia, especialidade de Ecologia, apresentada à Fac. de Ciências e Tecnologia de CoimbraA análise química exigida por lei para regulamentar o uso de lamas residuais na agricultura é claramente insuficiente para avaliar o risco potencial da utilização
deste tipo de resíduos em solo, dado que nem o efeito de contaminantes não incluídos na análise química nem os efeitos que ocorrem como resultado de interacções entre compostos químicos são tidos em linha de conta. Por essa razão a necessidade em complementar as análises químicas com a realização de uma bateria de bioensaios para uma adequada caracterização ecotoxicológica deste tipo de resíduos é amplamente reconhecida. Dos contaminantes frequentemente
encontrados em lamas residuais os metais constituem um risco potencial para os organismos edáficos. O grau de contaminação no solo é geralmente avaliado pela concentração total de metais; no entanto, o risco real é determinado pela fracção de metais que está biologicamente disponível para os organismos. Essa fracção está relacionada com a força da ligação do metal à matriz e pode variar ao longo do tempo devido a processos naturais ou antropogénicos. Além de factores abióticos, também processos biológicos, como a actividade das minhocas, são capazes de induzir mudanças na disponibilidade de metais, influenciando a sua distribuição no solo. Além da contaminação por metais, a toxicidade deste tipo de resíduos também pode estar relacionada com a presença de outros produtos químicos perigosos gerados por actividades humanas, como é o caso dos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAHs). Tem sido demonstrada a
capacidade das minhocas para promover a biodegradação de PAHs no solo. No entanto, até agora, o mecanismo através do qual as minhocas exercem essa influência ainda é desconhecido.
Neste contexto, os principais objectivos deste trabalho foram: i) contribuir para a discussão e definição de estratégias adequadas para a caracterização ecotoxicológica de resíduos; ii) avaliar as alterações na disponibilidade de metais numa lama contaminada com metais ao longo do tempo e o papel de alguns factores como a matriz de contaminação e a actividade de minhocas nessas alterações; e iii) avaliar a influência da actividade das minhocas em processos
microbianos do solo que possam estar de alguma forma relacionados com o aumento da biodegradação de PAHs.
No Capítulo 2, foi testada uma bateria de ensaios ecotoxicológicos com plantas (Brassica rapa e Avena sativa) e invertebrados do solo (Eisenia andrei e
Folsomia candida) para a caracterização ecotoxicológica de três lamas provenientes de fontes distintas (ETAR urbana e de indústria de processamento de azeite e galvanoplastia), fornecendo informações sobre os seus potenciais
riscos e "níveis seguros" de aplicação. Os resultados mostraram que a avaliação ecotoxicológica de resíduos pode ser usada como uma ferramenta de controlo
ambiental para a utilização de lamas na agricultura e apoiam a adopção de uma abordagem em diferentes etapas (“tiered approach”) para este efeito. No Capítulo 3 foi avaliada a adequabilidade do uso de ensaios de fuga com colêmbolos em etapas preliminares da avaliação de risco (”lower tier”), e a sua capacidade para despoletar ensaios de reprodução numa etapa posterior (”higher tiers”) nas
mesmas misturas de lama e solo utilizadas no Capítulo 2, após 0, 4 e 12 semanas de incubação. Os resultados comprovaram a eficiência destes ensaios de fuga na caracterização ecotoxicológica preliminar de lamas perigosas e ainda na avaliação das alterações da toxicidade ao longo do tempo. No Capítulo 4, foi
avaliada a toxicidade de uma mistura de crómio (Cr), cobre (Cu), níquel (Ni) e zinco (Zn) aplicada no solo directamente ou através de uma matriz orgânica por
intermédio de ensaios de reprodução com minhocas (E. andrei) e colêmbolos (F. candida). Os resultados demonstraram que uma avaliação comparativa deste tipo fornece informação útil sobre o efeito da lama (contaminantes) e da matriz na toxicidade dos metais.
No Capítulo 5, foram avaliadas as alterações na disponibilidade de metais a curto prazo, quando aplicados directamente no solo (solos com solução de metais) ou através de uma matriz orgânica (solos com lama) através de um ensaio de laboratório em microcosmos ao longo de 12 semanas. Os resultados
demonstraram que a matriz lama contribuiu, de um modo geral, para reduzir a mobilidade dos metais no solo. Nos solos contaminados com solução de metais a
disponibilidade de metais diminuiu independentemente da concentração e nos solos contaminados com lama a disponibilidade de metais manteve-se estável ao
longo do tempo em todas as doses. No Capítulo 6 foi realizada uma experiência complementar à apresentada no Capítulo 5, onde foram adicionadas minhocas da espécie Dendrobaena veneta aos microcosmos para avaliar a influência da
actividade das minhocas na disponibilidade dos metais a curto prazo. Os resultados mostraram que a actividade das minhocas não alterou a disponibilidade dos metais em nenhum tratamento ao longo do tempo, contudo interferiu no conteúdo em metais dos percolados. As concentrações de Ni, Cu e
Cr em D. veneta foram maiores nos tratamentos com concentrações de metais mais elevadas; já a concentração interna de Zn não apresentou esta tendência sendo regulada pelas minhocas. Modelos retirados da literatura não foram capazes de prever os níveis de metais medidos em D. veneta. No Capítulo 7, foi realizado um ensaio de mesocosmos em campo ao longo de um ano para avaliar as alterações na disponibilidade de metais a longo prazo, comparando também o efeito da matriz (solos contaminados com lama vs solução de metais) e a influência da actividade das minhocas (numa densidade realista de 500 minhocas D. veneta por m2). Os resultados não revelaram alterações na concentração de
metais totais mas demonstraram uma diminuição na extractabilidade do Ni ao longo do tempo. A actividade das minhocas não interferiu na concentração de
metais ao longo do tempo. As concentrações de Cr e Ni nas minhocas foram dependentes das respectivas concentrações no solo em alguns tratamentos e as
concentrações internas de Cu e Zn foram reguladas pelas minhocas. Os modelos testados estimaram melhor as concentrações de Cu, Ni e Cr nas minhocas, masnão as de Zn.
No Capítulo 8, foi realizada uma experiência de laboratório em microcosmos para avaliar a influência da colonização de minhocas na actividade microbiana
relacionada com a biodegradação de PAHs no solo. Foram efectuadas amostragens destrutivas de colunas de solo com um estrato superficial de sedimento dragado, contaminado predominantemente com PAHs, ao longo de 18 semanas, para medir parâmetros químicos e microbianos. Os resultados sugerem
que não há relação directa entre as alterações da actividade microbiana facilitada pela actividade das minhocas e o aumento da degradação dos PAHs no solo. No entanto, o papel das alterações na estrutura da comunidade microbiana do solo, induzida pelas minhocas, na remoção de PAHs necessita de mais investigação.Chemical analysis required by law to regulate sewage sludge use in agriculture is clearly insufficient to indicate potential risk of sludge amendments in soil
because neither the effect of contaminants not screened in chemical analysis nor the effects that occur as a result of multi-chemical interactions are taken into account. Because of that, the need for a test battery of ecotoxicological assays for a proper ecotoxicological characterization of sludges as a complement of chemical analysis is widely recognized. The high level of metals often found in sewage sludges constitutes a potential risk for soil organisms. The degree of soil contamination is generally evaluated by total metal concentrations; however, the real risk of metals is determined by the fraction that is biologically available for the organisms. The available fraction is highly related with the strength of metal binding by the matrix and may change over time due to natural or anthropogenic processes. Besides abiotic factors also biotic processes, like earthworm activity, may induce changes in metal availability by influencing metal partitioning in soil. Besides metal contamination, the toxicity of wastes may also be related to the presence of other hazardous chemicals generated by human activities, including polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). The ability of earthworms to promote biodegradation of PAHs in soil has been reported. However, until date, the mechanism through which the earthworms exert such influence is still unknown.
Under this context, the main objectives of this thesis were i) to discuss and give a contribute to the definition of suitable strategies for ecotoxicological waste characterization; ii) to evaluate the changes in metal availability of a metalcontaminated sludge over time and the role of factors like soil matrix and
earthworm activity in those changes; and iii) to evaluate the influence of earthworm activity on soil microbial processes that may be related with
increasing PAH biodegradation. In Chapter 2 a battery of ecotoxicological assays using plant (Brassica rapa and Avena sativa) and soil invertebrate species (Eisenia andrei and Folsomia candida) is proposed for the ecotoxicological characterization of three sludges
from distinct sources (urban, olive-processing, and electroplating industries), providing information on their potential hazard and identifying “safe”
application levels. Results showed that the ecotoxicological evaluation of wastes
can be used as an environmental safety control of sludge use in agriculture and that a tiered approach may be adopted for this purpose. The use of Collembola avoidance tests in a screening level (low tier) acting as a trigger for collembolan
reproduction tests (high tier) was assessed in Chapter 3 for the same soil-sludge mixtures used in Chapter 2 after 0, 4, and 12 weeks of incubation. Results
demonstrated the ability of collembolan avoidance tests to assess changes in sewage sludge toxicity over time and its potential for hazardous sludge
characterization at low tier levels. In Chapter 4, the toxicity of a mixture of chromium (Cr), copper (Cu), nickel (Ni), and zinc (Zn) applied to soil directly or
via an organic matrix was evaluated through earthworm (E. andrei) and Collembola (F. candida) reproduction tests. Results demonstrated that this
comparative approach provides useful information on the effect of the sludge matrix on the toxicity of metals.
In Chapter 5 the short-term changes in metal availability when applied to soil directly (metal-spiked soils) or via an organic matrix (sludge-amended soils)
were evaluated in a microcosm laboratory experiment over 12 weeks. Results demonstrated that the sludge matrix generally contributed to reduce the mobility
of metals in soil. In spiked treatments, metal availability decreased independently of test concentration and in sludge-amended soils the availability of metals remained stable over time in all treatments. In Chapter 6 a complementary experiment was performed with the inclusion of earthworms
(Dendrobaena veneta) to the microcosms to assess the influence of earthworm activity on metal availability on a short-term basis. Results showed that
earthworm activity did not affect metal availability of any treatment over time, but their burrowing activities did interfere with the metal content of percolates.
Nickel, Cu and Cr concentrations in D. veneta were higher at the highest treatment levels, whereas Zn internal concentration was regulated. Models taken
from the literature were not able to predict the metal levels measured in D.
veneta. In Chapter 7, an outdoors mesocosm experiment was conducted over one year to evaluate long-term changes of metal availability, also comparing the effect of the matrix (sludge amended vs spiked soils) and the activity of earthworms (a realistic density of 500 D. veneta per m2). Results showed no
changes in total metal concentrations and a decrease only in Ni extractability over time. Earthworm activity did not affect metal concentrations over time.
Earthworm Cr and Ni concentrations were dependent on soil metal concentrations in some treatments and internal Cu and Zn concentrations were
regulated by D. veneta. Models taken from the literature best estimated Cu, Ni, and Cr but not Zn concentrations in the earthworms.
In Chapter 8, a microcosm laboratory experiment was conducted to evaluate the influence of earthworm colonization and activity in facilitating microbial
processes related to the biodegradation of PAHs in soil. Columns containing a layer of dredge sediment contaminated predominantly with PAHs on top of
uncontaminated natural soil without and with low and high E. andrei densities were destructively sampled over 18 weeks for measurement of chemical and
microbial parameters. Results suggest no direct relationship between changes in the microbial activity mediated by earthworms and the increased PAH
degradation. However, the role in PAH decrease of shifts in soil microbial community structure induced by earthworms needs further investigation.O trabalho científico desta dissertação foi financiado pela Fundação para a
Ciência e a Tecnologia sob a forma de bolsa de investigação (referência: SFRH /BD / 29437 / 2006) co-financiada pelo Fundo Social Europeu no âmbito do Programa Operacional Potencial Humano do Quadro de Referência Estratégica Naciona
