Tanzi, Simone

I denne afhandling demonstreres højkvalitets målinger af ionkanalaktiviteten igennem cellemembranen i en biologisk celle ved anvendelse af den såkaldte "patch clamp" teknik på en sprøjtestøbt polymer mikrofluid chip. Sådanne målinger udføres traditionelt ved hjælp mikropipetter af glas, eller i de seneste år ved hjælp meget dyre microfluide chips til engangsbrug. Patch clamping metoden anvendes til både grundlæggende elektrofysiologiske studier på levende celler og i cellevæv og til "drug discovery".Resultaterne af dette arbejde vil gøre det muligt at direkte målinger af ionkanalaktivitet kan foretages på den billigste materiale- og produktionsplatform til dato, og med potentiale for meget højt throughput. Valget af et chip-design med brug af sidekanaler til indgangning af cellerne tillod at chips kunne fremstilles uden gennemgående huller og ved hjælp af en proces bestående af master-fremstilling ved brug af tør-æts i et silicium substrat, elektroplattering af en nikkel støbeform fra siliciummasteren, og endeligt sprøjtestøbning af plastikchips ved brug af nikkelformen. En grundig karakterisering af de kritiske mikrokanallysninger blev udført ved hjælp af SEM og AFM og viste høj replikationsnøjagtighed i hele produktionsprocessen.De mest kritiske chipparametre blev identificeret som længden af de kapillære sidekanaler til patching af cellerne og den meget lave overfladeruhed på indersiden af disse kaneler. Profilen af sidekanalerne fandtes at være mindre kritisk, da lysninger med forskellige profiler testet med celler viste den samme evne til at danne tætte forseglinger mod cellerne med ubetydelige lækstrømme. Evnen til at danne forsejlinger med høj elektrisk lækmodstand i omegnen af GOhm, de såkaldte "gigaseals", påvistes med en succesrate på 15%. Chips blev testet funktionelt med humane embryonale nyreceller (HEK), som udtrykte spændingsafhængige natriumkanaler og blev sammenlignet med et kommercielt state-of-the-art system til automatiserede ionkanalmålinger. Disse eksperimenter vedrørte strøm-spænding karakteristikken for aktivering og inaktivering af natrium kanaler og deres følsomhed over for et stof til lokalbedøvelse, lidocain. Både IV karakteristikkerne og lidocain dosisresponskurverne optaget med de sprøjtestøbte plastikchips var i fremragende overensstemmelse med resultaterne opnået på det kommercielle system.In this thesis we demonstrate high quality recordings of the ion channel activity across the cell membrane in a biological cell by employing the so called patch clamping technique on an injection molded polymer microfluidic device. Such recordings are traditionally made using glass micropipettes, or in recent years using consumable microfluidic chips of high costs. The patch clamping method is widely used both in fundamental studies of electrophysiology of living cells and tissue and in drug discovery.The findings of this work will allow direct recordings of ion channel activity to be made using the cheapest materials and production platform to date, and with the potential for very high throughput. The employment of cornered apertures for cell capture allowed the fabrication of devices without through holes via a process comprising master origination by dry etching in a silicon substrate, electroplating in nickel, and injection molding of the final part. A thorough characterization of the patching orifices by means of SEM and AFM showed high replication accuracy through the fabrication process.The most critical device parameters were identified as the length of the patching capillaries and the very low surface roughness inside of the capillaries. The cross-sectional shape of the cornered apertures was found to be less critical, as apertures with different profiles were tested with cells and showed the same ability to form tight seals with cells with negligible leak currents. The ability to form high resistance seals in the GOhm range, the so called gigaseals, is demonstrated with a success rate of 15%. The devices were functionally tested with Human Embryonice Kidney (HEK) cells expressing voltage-gated sodium channels and benchmarked against a commercial state-of-the-art system for automated ion channel recordings. These experiments considered current-voltage relationships for activation and inactivation of the sodium channels and their sensitivity to a local anesthetic, lidocaine. Both IVs and lidocaine does response curves obtained from the injection molded polymer device were in excellent agreement with data obtained from the commercial system

Online Research Database In Technology

High quality ion channels recordings on an injection molded polymer chip

http://orbit.dtu.dk/ws/files/77871369/PhD_thesis_Simone_Tanzi_2013_reduced_size..PDF

High quality ion channels recordings on an injection molded polymer chip

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Online Research Database In Technology