Secondo il paradigma centrale della radiobiologia gli effetti biologici dell'esposizione alle radiazioni ionizzanti si verificano soltanto nelle cellule irradiate, come risultato dell'interazione dell'energia con il nucleo.
Questi effetti possono essere sia diretti, a causa della ionizzazione delle molecole biologiche presenti nella cellula, sia indiretti, come conseguenza della generazione di radicali liberi e specie reattive dell'ossigeno. Il danno più grave che la cellula deve affrontare è a carico del DNA: le conseguenze di un danno non correttamente riparato, possono comprendere l'insorgenza di mutazioni geniche, aberrazioni cromosomiche, apoptosi e morte cellulare.
Nel corso degli anni, molti studi hanno descritto un fenomeno noto come effetto bystander, in cui si ha la manifestazione di danno al DNA in cellule non attraversate direttamente dalla radiazione, ma che sono venute in contatto con le cellule irradiate. L'effetto bystander può essere mediato da giunzioni gap, nel caso si abbia un contatto diretto tra cellule, o mediante il rilascio di fattori solubili nel mezzo di coltura da parte delle cellule irradiate. La conseguenza di questi segnali consiste in una vasta gamma di effetti, tra cui incremento della frequenza di micronuclei; insorgenza di aberrazioni cromosomiche; un maggior numero di scambi tra cromatidi fratelli; riduzione della sopravvivenza cellulare e un aumento dei fenomeni apoptotici.
Lo scopo di questo lavoro è stato quello di determinare la capacità di mutageni chimici di indurre un effetto bystander in colture di linfociti umani periferici. Le sostanze scelte per effettuare questo studio sono molecole con diverso meccanismo di azione (aneuploidogeno o clastogeno): inizialmente, per ciascuna sostanza presa in esame, è stato identificato il range di concentrazione efficace per eseguire il trattamento, compatibile con la procedura sperimentale da seguire. In seguito sono utilizzati due diversi approcci per verificare la capacità di ogni sostanza di indurre tale effetto: 1) trasferimento del terreno di coltura dalle colture trattate (definite come donatrici) alle colture non trattate (definite come riceventi) 2) co-coltura di sangue periferico proveniente da donatori di sesso diverso, differenzialmente marcate con una sonda FISH specifica per il cromosoma Y. In entrambi i casi, la valutazione del danno genotossico è stata eseguita in interfase mediante test del micronucleo (MN).
In una seconda fase dello studio, è stata analizzata la composizione del mezzo condizionato, ovvero il terreno di coltura in cui si suppone siano presenti i fattori solubili, prodotti dalle cellule del donatrici, capaci di indurre una risposta bystander. A questo scopo, sono state utilizzate due molecole fluorescenti che hanno permesso di rilevare il coinvolgimento delle specie reattive dell'ossigeno e dell'azoto, già note in letteratura come mediatori di questo effetto. Infine, alla luce dei risultati ottenuti nella prima fase dello studio è stata condotta la separazione elettroforetica del mezzo condizionato proveniente da colture donatrici sottoposte a tre diversi trattamenti, con lo scopo di identificare eventuali differenze nella sua composizione proteica.
ABSTRACT:
According to the fundamental paradigm of radiobiology, biological effects of exposure to ionizing radiation occurs only in irradiated cells, as a result of the interaction of energy with nucleus.
Biological effects occur, either directly, due to the ionization of biological molecules in the cell, or indirectly, i.e. generation of free radicals and reactive oxygen species. However, the most severe damage is inflicted to the DNA: the consequences of an uncorrectly repaired damage, manifest as gene mutations, chromosomal aberrations, apoptosis and cell death.
Over the years, many studies have described a phenomenon known as bystander effect that consists in the appearance of DNA damage in non targeted cells, which have been in contact with irradiated cells. Bystander effect may be mediated by gap junctions, in case of direct contact between cells, or by the release of soluble factors in culture medium from irradiated cells. The consequence of these signals results in a wide range of effects, including an increase in the frequency of micronuclei, chromosomal aberrations, increase of sister chromatid exchanges, reduction of cell survival and apoptosis.
The purpose of this study is to determine the ability of chemicals to induce bystander effect in cultures of human peripheral lymphocytes. The substances chosen to perform this study are molecules with different mechanism of action (aneuploidogenic or clastogenic): initially, it was necessary to identify for each substance under consideration, the effective dose range for treatment compatible with the chosen experimental procedure. Two different approaches were used to verify the ability of each substance to induce this effect: 1) transfer of culture medium from treated cells (defined as donor) to untreated cells (defined as receivers) 2) co-culture of peripheral blood from different sex donors, subsequently labeled with a FISH probe specific for Y chromosome. In both cases, the evaluation of genotoxic damage was performed in interphase using micronucleus test (MN).
In a second phase of the study, the composition of conditioned medium (the culture medium in which it is assumed are present soluble factors produced by donor cells, capable of inducing a bystander response) has been studied. To this purpose, two fluorescent probes has been used in order to detect the involvment of reactive oxygen and nitrogen species, already known in literature as mediators of this effect. Finally, in light of the results obtained in the first phase of the study, an electrophoretic separation of conditioned medium obtained from three different-treated donor cultures has been performed, in order to identify any differences in protein composition
