Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013O complexo Burkholderia cepacia (Bcc) é constituído actualmente por 18 espécies de bactérias patogénicas oportunistas, capazes de causar infecções respiratórias graves e por vezes letais doentes com fibrose quística (FQ). A FQ é uma doença genética autossómica recessiva mais comum em caucasianos e é causada por mutações no gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), que está localizado no cromossoma 7 e codifica uma proteína de 1480 aminoácidos que funciona como canal transportador de iões cloreto (Cl-) nas membranas epiteliais. Vários estudos têm sido realizados com o objectivo de entender quais os mecanismos moleculares associados aos processos de colonização e persistência destas bactérias nos doentes com FQ. Normalmente, os organismos pertencentes ao Bcc começam por colonizar o tracto respiratório dos doentes com FQ, podendo em alguns casos invadir o epitélio e sobreviver dentro de células epiteliais e de macrófagos. As infecções causadas pelo Bcc em doentes com FQ têm um desenvolvimento clinico imprevisível, variando desde assintomático até ao “síndroma cepacia”, uma pneumonia necrotizante rápida e fatal, que pode levar à morte do paciente num período de tempo de cerca de uma semana. Estas bactérias possuem ainda uma elevada resistência a múltiplos antibióticos, o que dificulta a sua erradicação. Vários factores de virulência têm sido descritos para as bactérias do complexo Burkholderia cepacia, tais como sistemas de “quorum-sensing” (QS), produção de biofilmes, produção de exopolissacáridos (EPS), ilhas genómicas e a multirresistência a antibióticos, entre outros Sabe-se actualmente que o mensageiro secundário di-guanilato cíclico (c-di-GMP) desempenha um papel importante na biologia das bactérias. Devido à sua interacção com várias moléculas efetoras, o c-di-GMP tem uma função regulatória a nível dos processos de transcrição e tradução e na actividade e estabilidade de proteínas. Este permite controlar uma grande variedade de funções relacionadas com o comportamento da comunidade, a secreção, adesão e mobilidade, contribuindo para a virulência de organismos patogénicos. No entanto, ainda pouco se sabe sobre os mecanismos reguladores envolvidos. A caracterização dos mecanismos associados à regulação pelo c-di-GMP representa um dos principais desafios na compreensão das suas funções. No género Burkholderia, o c-di-GMP está envolvido na síntese de flagelos, mobilidade, formação de biofilmes e na invasão e citotoxicidade para as células humanas. Os níveis intracelulares de c-di-GMP são controlados pelas enzimas diguanilato ciclase (DGC) e fosfodiesterase (PDE). As DGC canalizam a sintetize c-di-GMP a partir da condensação de duas moléculas de GTP, enquanto que a actividade de PDE cataliza a hidrolise do c-di-GMP em pGpG. As proteínas com actividades DGC e PDE apresentam, respectivamente, os motivos GG(D/E)EF e EAL. Vários estudos com o objectivo de encontrar genes que codifiquem para proteínas DGC com domínio PAS revelaram a presença de 3 genes no genoma de B. cenocepacia J2315. Estes genes são conservados nos genomas de outras estirpes do Bcc. Diversos estudos têm vindo a demonstrar que concentrações elevadas de c-di-GMP podem suprimir a mobilidade e estimular a formação de biofilmes e a produção de componentes superficiais, tais como a celulose. Estas consequências no comportamento bacteriano devido a elevados níveis de concentração de c-di-GMP podem levar a um bloqueamento das células num estado séssil. Em contraste, baixos níveis de concentração de c-di-GMP vão ter consequências opostas, inibindo portanto a formação de biofilmes e a produção de componentes superficiais, estimulando a mobilidade. Assim, é possível estabelecer a ligação entre os níveis de c-di-GMP e o comportamento e adaptação bacteriana a ambientes específicos. A concentração intracelular de c-di-GMP pode ser rapidamente modulada através do aumento da expressão de proteínas com domínios GGDEF e EAL, alcançando assim respectivamente a saturação ou o esgotamento, do conteúdo intracelular de c-di-GMP na célula. O trabalho desenvolvido teve como principal objectivo o estudo do papel da sinalização pelo mensageiro secundário c-di-GMP na adaptação de bactérias do Bcc a condições ambientais típicas dos pulmões de doentes com Fibrose Quística. Com este objectivo, foram seleccionados 2 genes (BCAM0580 E BCAM2836) de B. cenocepacia J2315 que codificam para DGCs. Com este trabalho foi possível estabelecer uma associação entre a presença de níveis elevados de proteínas com os domínios conservados EAL e GGDEF e a produção de EPS e virulência. No entanto, não foram detectadas diferenças significativas com a superexpressção dos genes BCAM0580 e BCAM2836, indicando que é necessário mais trabalho para adquirir mais conhecimentos sobre os papéis desempenhados pelo mensageiro secundário c-di-GMP na virulência do Bcc. Este trabalho contribuiu para esclarecer o papel do mensageiro secundário c-di-GMP como um factor de virulência, o que permitiu um conhecimento mais profundo da biologia destes patogénicos. Este estudo contribuiu para a identificação de novos alvos para a identificação de novos agentes antimicrobianos ou para a implementação de novas e melhores estratégias terapias para a irradicação destes patogénicos.The Burkholderia cepacia complex (BCC) currently comprises 18 species of opportunistic pathogenic bacteria capable of causing and often lethal respiratory infections in patients with cystic fibrosis (CF). Several studies have been performed envisaging the understanding of the molecular mechanisms underlying the processes associated with the colonization and persistence of these bacteria in the respiratory tract of patients with CF. It is now well known that the action of the second messenger cyclic di-guanylate (c-di-GMP) is involved in the adaptive process to new environmental conditions. Due to their interaction with various effector molecules, c-di-GMP has a regulatory function at the levels of transcription and translation processes, and on the activity and stability of proteins. The intracellular levels of c-di-GMP are controlled by the enzyme activities diguanylate cyclase (DGC) and phosphodiesterase (PDE). The DGC enzyme activity synthesizes c-di-GMP by condensing two GTP molecules, while the PDE enzyme activity catalises the hydrolysis of c-di-GMP into pGpG. Proteins with DGC and PDE activities have, respectively, the GG(D/E) EF and EAL domains. A bioinformatic study was initiated to find genes which encode for DGC proteins. This analysis revealed the presence of three genes enconding putative DGC proteins in the genome of B. cenocepacia J2315 The studied of the role of the second messenger signaling c-di-GMP in the biology of Bcc bacteria involved the functional characterization of two B.cenocepacia J2315 genes encoding DGCs domain. In this work we were able to establish an association between the presence of increased levels of proteins with the conserved domains EAL and GGDEF and the production of EPS and virulence. However, no significant differences were detected when overexpressing the BCAM0580 or BCAM2836, indicating thet further work is necessary to gain knew knowledge on the roles played by the secong messenger c-di-GMP on Bcc virulence
