Tese de mestrado [versão pública]. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013Adenovirus-based vectors are among the most efficient and disseminated gene transfer vehicles currently in use in a broad range of basic and applied research applications including the testing of gene therapy. As a gene therapy modality, gene targeting relies on the site-specific genome modification based on “integrases” or on the error-free homologous recombination pathway of the cell. Here, by deploying engineered nucleases together with targeting donor DNA delivered by adenoviral vectors, was tested the influence of the homologous donor topology on the specificity and the accuracy of gene targeting. Was shown clear evidence for the susceptibility of adenoviral vector DNA to the catalytic activities of FLPe recombinase and TALEN proteins. Also, the excision of donor DNA from the context of AdV genomes leads to an increase in stable transduction levels with the majority of integrants having precise HR-derived junctions at both ends, indicating that the vector topology greatly impacts the outcome of the genomic editing process.O domínio científico da terapia genética tem, nos últimos anos, sido alvo de grande expansão e desenvolvimento, sendo descrita como a introdução de nova informação genética, por meio de vetores, em células de um indivíduo com a finalidade de corrigir um defeito no genoma. Muitas dessas correções têm como alvo genes implicados em doenças, como na distrofia muscular de Duchenne, uma doença ligada ao cromossoma X. A ambição de uma cura genética tem impulsionado a descoberta e aperfeiçoamento de ferramentas úteis a essa ciência, tanto na área dos vetores utilizados (nomeadamente os sistemas víricos), como em endonucleases de restrição como as nucleases ZFNs e TALENs. Vetores baseados em adenovírus estão entre os veículos de transferência de genes mais eficientes e são, atualmente, de utilização disseminada. São utilizados numa grande variedade de aplicações de pesquisa básica e aplicada e apresentam características que os distinguem dos restantes sistemas utilizados, como uma eficiente transdução da maioria dos tecidos, uma grande capacidade de acomodação de transgenes e a forma episomal em que o seu genoma permanece na célula, impedindo indesejáveis integrações aleatórias no genoma. Com o consecutivo melhoramento da ciência, também os vetores baseados em adenovírus foram sucessivamente aperfeiçoados, tendo a remoção total ou parcial de genes virais não essenciais, aumentado o tamanho de acomodação do transgene e diminuindo as respostas imunitárias ao vector. Atualmente são descritos essencialmente três tipos de vetores adenovíricos: primeira-geração, segunda- e terceira-geração e high-capacity, com deleções nos genes virais E1, E2/E4 e em todos os genes, respectivamente. Uma das modalidades da terapia genética, a terapia genética targeted, baseia-se na modificação, através de "integrases" ou na via de recombinação homóloga da célula, do genoma numa localização específica, como o locus humano AAVS1, no cromossoma 19, um local largamente utilizado para integração de genes exógenos. A recombinação homóloga é uma via, isenta de erros, de reparação de quebras de ADN utilizada pela célula e é dependente da existência de uma sequência dadora (ADN dador), homóloga em parte com a sequência onde a quebra se deu. Por recombinação entre as duas sequências dá-se troca de informação genética complementar e a correção da quebra. Este sistema é muito utilizado em terapia genética, nomeadamente em sistemas de correção de mutações, mutagénese ou de inserção genética específica. Apesar de ser uma via de reparação eficiente, a célula utiliza mais prontamente uma outra via de reparação: a “non-homologous end joining”, em que, como o nome indica, liga as duas pontas livres, produzindo erros no processo. Para uma terapia genética eficiente e livre de erros, a recombinação homóloga deve ser induzida preferencialmente. Sabe-se que este sistema é recrutado preferencialmente em quebras duplas de ADN e a introdução exógena destas lesões por endonuclases de restrição, como as ZFNs e TALENs, pode aumentar a frequência de ocorrência da recombinação homóloga. Transcription activator-like effectors (TALEs) são proteínas encontradas na bactéria fitopatogénica do género Xanthomonas e que funcionam essencialmente como activadores transcripcionais. A estrutura modular e a sua capacidade de ligação ao ADN numa relação de um-para-um (resíduo-nucleótido) altamente específica fazem com que, associadas à enzima de restrição FokI, tenham dado origem às nucleases TALENs que, após dimerização dos domínios FokI, produzem uma quebra dupla na sequência desejada. As proteínas TALEN podem ser introduzidas na célula eficientemente através de vetores víricos como os vetores adenovíricos. No presente trabalho, através da transferência de TALENs (específicas para o locus AAVS1 humano) e de ADN dador, por vetores adenovíricos de segunda-geração, foi testada a influência da topologia do ADN dador homólogo sobre a especificidade e a precisão da terapia genética targeted. Os dadores homólogos foram construídos numa base genómica adenovírica, com duas sequências homólogas ao locus AAVS1, flanqueando o transgene eGFP direcionado por um promotor PGK. As topologias finais dos dadores foram produzidas a partir de reacções em sequências clonadas: flipase recognitition target (FRT), TALEN-target site (T-TS) e adeno-associated virus inverted terminal repeat (AAV-ITR). Pela recombinação das sequências FRT, mediada pela recombinase flipase, resultou um dador circular; pela libertação do dador do contexto adenovírico, mediado pela quebra dupla por TALENs nas sequências T-TS, foi produzido um dador linear e pelas sequências AAV-ITR, foi produzido um dador com estruturas secundárias terminais com recrutamento de fatores de reparação. Após aquisição da topologia final, e por quebra dupla específica no locus AAVS1 mediada pelas TALENs, a via de recombinação homóloga será recrutada, levando à recombinação entre as sequências homólogas no locus e no ADN dador e, consequentemente, à integração do transgene. Após a caracterização dos vetores por análise enzimática de restrição, demonstrou-se evidências da suscetibilidade do ADN vetor dador para as atividades catalíticas da flipase e das proteínas TALEN através de técnicas de PCR. A atividade de transferência dos dadores pelos vetores adenovirais foi determinada por titulações em células Hela, após as quais se procedeu às experiências de transdução, tanto em células HeLa como em mioblastos derivados de pacientes com distrofia muscular de Duchenne. No sentido de investigar a especificidade e precisão da recombinação, mediada por TALENs, dos diferentes dadores no locus-alvo AAVS1, a frequência de células positivas para eGFP foi monitorizada por citometria de fluxo ao longo do período de tempo em que as células transduzidas foram mantidas em cultura. Observou-se na primeira experiência de transdução, em células HeLa, que apesar dos elevados níveis iniciais de células positivas para eGFP, essas frequências rapidamente diminuiram e, após 28 dias, foram consideradas como níveis basais em todas as condições à excepção das células transduzidas com o dador linear (com sequências T-TS) em combinação com as TALEN. Esta condição apresentou 1.7 vezes maior frequência de células positivas para eGFP que o dador controlo. O período da experiência foi suficiente para diluir as formas episomais do vetor, sendo este valor final resultado da integração genómica do transgene. Uma segunda experiência de transdução em células HeLa, neste caso utilizando somente o dador linear (T-TS) e as TALENs, confirmou os resultados da experiência inicial. Uma última experiência de transdução foi feita, utilizando mioblastos derivados de pacientes de Duchenne e, para além do dador linear T-TS, um dador normal para comparação. Igualmente nesta experiência, o dador linear em combinação com as TALEN revelou uma frequência de células positivas para eGFP mais elevada que o dador controlo. Porque um aumento nos níveis de eficiência de integração do transgene não demonstra directamente um equivalente aumento na especificidade, procedeu-se a uma avaliação desse parâmetro por experiências de PCR. Para isso, isolaram-se clones de células HeLa da primeira experiência, positivos para eGFP, da condição do dador linear T-TS em combinação com as TALEN. Primers foram desenhados de forma a ser avaliada a integração do transgene, tanto na extremidade 5’ como na 3’ do locus-alvo AAVS1, assim como primers para o gene eGFP como controlo interno. Em 30 clones isolados, somente 22 clones (73%) revelaram junções do locus provenientes de recombinação homóloga. Com base nos resultados deste trabalho pode-se afirmar que o contexto do vetor influencia a especificidade e a precisão do processo de edição genético. Comparação com outros sistemas víricos poderá levar ao desenvolvimento de ferramentas e sistemas mais eficientes e seguros para o campo da terapia genética
