Golbano Rodríguez, Arantxa

Universitat Autònoma de Barcelona. Facultat de Biociències

Diposit Digital de Documents de la UAB

WISKOTT ALDRICH SYNDROME GENE EDITING IN HUMAN CD34+ CELLS USING TRANSCRIPTION ACTIVATOR-LIKE EFFECTOR NUCLEASES(TALENs)Wisko&‐Aldrich syndrome (WAS) is a rare and severe X‐linked primary immunodeficiency (PID) caused by mutaAons in WAS gene coding for the WAS protein (WASp), a cytoplasmic protein, expressed exclusively in hematopoieAc cells and involved in acAn cytoskeleton reorganizaAon. The disorder  is characterized by micro‐thrombocytopenia, eczema,  recurrent  infecAons, higher suscepAbility  to develop autoimmune manifestaAons and  lymphoid malignancies. Allogeneic hematopoieAc stem cell  (HSC)  transplantaAon  is a highly effecAve curaAve opAon although limited by the availability of donors. Therefore, ex vivo gene therapy using autologous HSC could represent a valid opAon in paAents without HLA‐matched donors and severe clinical signs. So for that, several studies have been conducted using viral vectors. The first clinical trial using a gamma‐retroviral  (RV)  vector  showed  restoraAon of WASp expression  in mulAple  lineages and an  improvement of  the  clinical  condiAon of paAents.[1] However,  the occurrence of  four  cases of  leukemia  reported  in 4 out of  the 10 paAents  treated and other  cases of  inserAonal mutagenesis brought about by the use of RV vectors show the drawbacks of the treatment with such vectors.[2] On the other hand, self‐inacAvaAng lenAviral vectors (LV) may represent a substanAal enhancement in terms of safety profile. Moreover, a clinical trial (phase I/II) using LV‐transduced autologous CD34+ cells started in 2011[3] , but we can not rule out the possibility of inserAonal mutagenesis. To overcome this problem, an alternaAve approach using engineered nucleases for precise genome ediAng is proposed. We will use TALENs in a genome‐ediAng strategy whereby we targeted a specific common WAS gene mutaAon (665C>T) to be edited.Engineered nucleases are composed by sequence‐specific DNA‐binding domains fused to a nonspecific DNA cleavage module, enabling  efficient  gene modificaAons  by  introducing  targeted  DNA  double‐strand  breaks  (DSBs)  that  sAmulate  both,  error‐prone nonhomologous end joining (NHEJ) and homology‐directed repair (HDR) DNA repair pathways. A TALEN consists on an engineered  TALE  repeaAAve array  fused  to  the  FokI  nuclease domain.  Their  targeAng  specificity  is  determined by  a  central repeaAAve  and  conservaAve  unit  containing  33‐35  amino  acids  with  only  two  hypervariable  residues  (repeat  variable diresidues,  RVD)  located  at  posiAons  12  and  13.  These  RVD  determine  the  target  nucleoAde  sequence,  through  the interacAons between RVD: NN, NI, HD, and NG and the DNA bases: guanine, adenine, cytosine, and thymine, respecAvely.INTRODUCTION1. Target, construct and validate a WAS TALENa. To target a WAS gene sequence for poten=al TALEN sites nearby 665 C>T muta=onb. To construct and validate an efficient TALENc. To iden=fy TALEN on target ac=vity and off target ac=vity2. Test and select TALEN in vitro edited cells a.  To  design  an  oligonucleo=de  donor  (ODN)  containing  the  correct  base  and  a floxed‐PGK‐puromycin casseSe as a selec=on methodb. To select TALEN‐edited cellsc. Test WASp expression on TALEN‐edited cells3. Test in vivo correc=onOBJECTVES1.  Target a  TALEN site. Using  the  TALENT  Library  Resource database [5] a TALENT target site was chosen, proximal to 665 C>T premature stop codon (PSC). 2. Genera3on of pa3ents‐specific nuclease. 3.  Cloning  into  GoldyTALEN  mini‐CAGGs promoter expression casseBe. TALEN as DNA.  14. Biodistribu3on analysis of human derived cells. Different organs (BM, thymus, spleen, and liver) will be analysed by flow cytometry using diferent cell markers, aier 8 weeks. 4.  Cloning  into  RCIscript‐GoldyTALEN vector. TALEN as mRNA.5. CD34+ cells transduc3on. TALENs transducAon delivered as either DNA or mRNA.6. Surveyor nuclease assay. Genomic PCR (gPCR) is used to amplify the TALEN target region from a heterogeneous populaAon of TALEN‐modified and TALEN‐unmodified cells, and the gPCR products are reannealed slowly to generate  heteroduplexes.  The  reannealed  heteroduplexes  are  cleaved  by Surveyor  nucleases, whereas  homoduplexes  are  lei  intact.  ConfirmaAon  by sequencing.7.  Correc3ve  donor  assembly.  The  double‐stranded  plasmid  DNA donor is composed by WAS genomic sequences comprising a right arm (899 bp long), and a lei arm (547bp long) that contains the 665 C>T mutaAon corrected. Lei and right arms are cloned into a floxed‐PGK‐puromycin casse&e, flanked by loxp  sites  and  oriented  such  as  it  would  be  knoked  into  the  intron  between exons 7 and 8.8. Selec3on. DeliveraAon of donor and TALENs as either plasmid DNA or 9.  TALEN‐edited  cell  screening.  PCR  analysis  of  both  post‐TALEN‐treated  subpools  and  clones,  using  the  primers  indicated  with  arrows. ConfirmaAon by sequencing.10.  Puromycin  casseBe  removal. Using  Cre/loxP  system.  Expression  of  cre‐recombinase,  assembly  at  the  loxP  sites  as  a dimer.  InducAon  of  recombinaAon  between loxP  sites  as  a  tetramer  and,  excision  of  the floxed DNA sequence.11. WASp expression analysis. Western Blot 12. OT analysis.  IntroducAon of  an  integrase‐defecAve  lenAvirus (IDLV) expressing a green fluorescent protein (GFP) marker gene into 293  cells,  in  presence  or  absence  of  TALENs.  PCR  analysis  using  an LTR‐specific primer and a WAS primer. Mapp  the  integraAon  sites  (IS)  with  classical  and  nonrestricAve  linear amplificaAon–mediated PCR  (LAM and  (nr)LAM‐PCR) and perform a deep sequencing on the stable populaAon of GFP cells. 13. TALEN‐edited CD34+ cells transplanta3on. Corrected CD34+ cells are transplantated  MATERIALS AND METHODS6. Target locus analysis would bear out the nuclease efficacy at the target site and higher rate of NHEJ expected from TALEN delivered as DNA species.9. Screening of subpool cells would be posi3ve for PCR product (minimum 80%). Moreover, subsequent clones would show higher frequency of correc3on when using DNA as a delivery vehicle.11. TALEN‐modified cells with the corrected muta3on would recover protein produc3on.12. GFP IDLV inser3on would be showed only when TALENs are cointroduced with the IDLV. Furthermore, aber the IDLV delivery we would see a rapid loss of GFP. In contrast, the cointroduc3on of IDLV and TALENs would result in a stable popula3on of GFP cells. In silico studies show that our TALEN has no off‐target sites, our study would confirm this data. EXPECTED RESULTSREFERENCESb. Test biodistribu=on, differen=a=on and engraUment of corrected CD34+cellsEngineered nucleases: TALENUsing the Golden Gate assembly method. mRNA to CD34+ cells, selecAon in bulk using puromycin, sequestraAon into subpools, and finally, isolaAon and expansion of clones.into Rag2‐/‐/c‐/‐ neonate mice, which had been sublethally irradiated . Control animals will be transplantedwith the same amount of unmanipulated (UM) CD34+ cells from helthy donors.analysis  in  different  cell  lines  derived  from  CD34+cells, comparing TALEN‐treated with untreated mutant cells. 14. The engrabment of human CD45+ cells would be comparable with mice injected with manipulated and UM cells in all the organs tested. No significant differences would be observed between different treatment groups neither in terms of level engrabment nor in differen3a3on paBern in tested organs. Therefore, corrected cells would be present in all hematopoie3c organs.a. To transplant TALENT edited cells into Rag2‐/‐/gamma‐c‐/‐ mice Bulk puromycinSubpoolsClonal derivation and expansionArantxa Golbano Rodríguez, Universitat Autònoma de Barcelona, Barcelona, Spain. (2013)1. Boztug K, et al. (2010). Stem‐cell gene therapy for the Wisko&–Aldrich syndrome. N Engl J Med, 363:1918‐1927.2.  Avedillo  Diez,  et  al.  (2011).  Development of novel  efficient  SIN vectors with  improved  safety  features  for Wisko&‐Aldrich  syndrome stem cell based gene therapy. Mol. Pharm. 8, 1525–1537.3. Scaramuzza S, et al. (2012). Preclinical safety and efficacy of human CD34(+) cells transduced with lenAviral vector for the treatment of Wisko&–Aldrich syndrome. Molecular Therapy.4.  Ning  Sun,  Huimin  Zhao  (2013).  TranscripAon  AcAvator‐Like  Effector  Nucleases  (TALENs):  A  Highly  Efficient  and  VersaAle  Tool  for  Genome EdiAng. Biotechnology and Bioengineering5.  Yongsub  Kim,  Jiyeon  Kweon  et  al.  (2013).  A  library  of  TAL  effector  nucleases  spanning  the  human  genome.  Nature  biotechnology, 31,3:251‐2596. Neville E Sanjana, et al. (2012). A transcripAon acAvator‐like effector toolbox for genome engineering. Nature Protocols 7, 171–192 7. Richard Gabriel, et al. (2009). Comprehensive genomic access to vector integraAon in clinical gene therapy.  Nature Medicine 15, 1431 ‐ 1436 [4][7][3][6][6]A. GolbanoA. GolbanoA. GolbanoA. GolbanoA. GolbanoA. GolbanoA. Golbano

Wiskott Aldrich syndrome gene editing in human CD34+ cells using transcription activator-like effector nucleases (TALENs)

http://ddd.uab.cat/pub/tfg/2013/113835/TFG_arantxagolbanorodriguez.pdf

Wiskott Aldrich syndrome gene editing in human CD34+ cells using transcription activator-like effector nucleases (TALENs)

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Diposit Digital de Documents de la UAB