Rossmann, Susanne Elisabeth

English

Rossmann, S.

MPG.PuRe

Analysis of the Lateral suppressor pathway in tomato axillary meristem formation.

Kölner UniversitätsPublikationsServer

AbstractAxillary meristems (AMs) play a crucial role in the elaboration of the aerial architecture ofseed plants. They are initiated in the boundary region between the shoot apical meristem(SAM) and leaf primordia. One of the most important and most specific regulators of thisprocess is Lateral suppressor (Ls), which belongs to the GRAS gene family. The aim ofthis work was to analyze the process of AM initiation in tomato in detail and to elucidatethe function of Ls.Morphological and histological analyses revealed that AMs are initiated in wild-type (wt)axils of P6 leaf primordia. During late development of P6 leaf primordia, proliferationof meristematic cells in leaf axils was observed by Histone H4 transcript accumulation(cell division marker), which was completely absent in the loss-of-function mutant lateralsuppressor-1 ls-1, suggesting a role of Ls in very early steps of AM initiation. Further-more, RNA in-situ hybridization experiments revealed a boundary specific transcriptionof Ls in axils of P1 to P5 leaf primordia. In axils of P6 primordia, Ls expression wasdetected only adaxial of incipient AMs. Surprisingly, Ls transcripts were also found toaccumulate in distal boundaries of leaflets in P4 to P6 leaf primordia. The formation ofleaflets as present in adult tomato leaves is characteristic for compound leaf development.Interestingly, wt tomato leaves can produce ectopic shoots in distal junctions of petioluleand the rachis, triggered by decapitation and intensive pruning of the plants. In contrast,the ls-1 mutant lacks the ability to produce ectopic shoots on its leaves, whereas trans-genic plants expressing a Ls enhancer construct (ls-1 GSET12) frequently develop ectopicshoots in the sinus of finger-shaped cotyledons, indicating that Ls is involved in ectopicshoot formation. Combined, these data suggest two putative functions of LS: keeping cellsmorphogenetically competent to initiate AMs in leaf axils and to form ectopic shoots inboundaries of leaflets at later stages of development.To identify target genes of Ls, transcript profiles of leaf axils between wt and ls-1 werecompared in an RNA-Seq analysis. In total, 60 differentially expressed genes (≥2-foldchange and FDR corrected p-value<0.05) were identified, and two candidates (TPSI1 andAP1µ1 ) could be confirmed as targets of Ls. TPSI1, which is inducible by phosphatestarvation, was found to be 2- to 5-fold upregulated in ls-1 according to RNA-Seq and1qRT-PCR data. Transcripts of TPSI1 accumulated in axils of ls-1, but not in wt, sug-gesting Ls as a repressor of TPSI1 in leaf axils. In contrast, AP1µ1 was identified asa gene being activated by Ls. Supported by RNA-Seq and qRT-PCR expression data,AP1µ1 was found to be 5- to 6-fold downregulated in ls-1. RNA in-situ hybridizationsrevealed a defined expression of AP1µ1 in leaf axils at a position where subsequentlynew AM will form. Known from animal studies, AP1µ1 is a subunit of the adapter pro-tein complex 1, which is required to recruit clathrin for vesicle-mediated transport of cargomolecules. A possible function of AP1µ1 in the formation of AMs is discussed in this work.The NAC domain transcription factor Goblet (Gob), the single ortholog of the ArabidopsisCUP-SHAPED COTYLEDON1 (CUC1 ) and CUC2 genes, exhibits a boundary specificexpression pattern in axils of leaf primordia similar to Ls. In order to unravel whetherboth genes act in the same pathway, and to elucidate the hierarchical order, qRT-PCRexpression analysis was performed in gob-3 loss-of-function mutants, and Ls was foundto be downregulated. Furthermore, AP1µ1 was downregulated, whereas TPSI1 was up-regulated in gob-3 apices, suggesting Ls and its targets to be positioned downstream ofGob.2ZusammenfassungAchselmeristeme spielen eine bedeutende Rolle bei der Entstehung der oberiridischenSprossarchitektur von Samenpflanzen. Sie werden im Grenzbereich zwischen dem Spross-apikalmeristem und Blattprimordien angelegt. Lateral suppressor (Ls), aus der Familie derGRAS Gene, ist einer der wichtigsten und spezifischsten Regulatoren in diesem Prozess.Das Ziel dieser Arbeit war es, die Entstehung von Achselmeristemen in Tomate na¨her zuuntersuchen sowie die Funktion von Ls aufzukla¨ren.Morphologische und histologische Untersuchungen ergaben, dass im Wildtyp Achselmeris-teme in Blattachseln des Primordiumstadiums P6 angelegt werden. In Blattachseln vonbereits sehr weit entwickelten P6 Blattprimordien wurden meristematische Zellen be-obachtet, die Transkripte des Histone H4 Gens (Zellteilungsmarker) akkumulierten, welchein der ls-1 Mutante fehlten. Dies deutet darauf hin, dass Ls bereits in einem sehr fru¨henStadium an der Bildung von Achselmeristemen beteiligt ist. Weiterhin wurde in RNAin-situ Hybridisierungen gezeigt, dass Ls spezifisch in Blattachseln der Stadien P1 bisP5 transkribiert wird. In P6 Blattachseln wurde die Expression von Ls nur noch adax-ial von gerade entstehenden Achselmeristemen beobachtet. Erstaunlicherweise wurden LsTranskripte ebenfalls in Blattprimordien (P4-P6) gefunden, und zwar in distalen Grenzbe-reichen von Blattfiedern. Die Bildung von Blattfiedern ist charakteristisch fu¨r die Entwick-lung gefiederte Bla¨tter, wie sie in adulten Tomatenbla¨ttern vorzufinden ist. Entfernt manden Haupttrieb sowie sa¨mtliche Seitentriebe, ko¨nnen Wildtyptomatenbla¨tter interessanter-weise ektopische Triebe auf Bla¨ttern bilden, und zwar an der distalen Verbindungsstelle vonBlattfiedersta¨ngeln mit der Blattspindel. Die ls-1 Mutante besitzt diese Fa¨higkeit nicht,wohingegen in transgene Pflanzen, in denen die Transkription von Ls versta¨rkt wurde(ls-1 GSET12), ha¨ufig die Bildung ektopische Triebe auf fingerfo¨rmigen Keimbla¨tternbeobachtet wurde. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass eine Funktion vonLs sein ko¨nnte, Zellen in einem morphogenetisch kompetenten Zustand zu halten, umAchselmeristeme in Blattachseln anzulegen, sowie zu einem spa¨teren Entwicklungszeit-punkt ektopische Triebe in Grenzbereichen von Fiederbla¨ttern zu bilden.Um Zielgene von Ls zu identifizieren, wurden in einer RNA-Seq Analyse die Transkrip-tomprofile der Blattachseln zwischen Wildtyp und ls-1 miteinander verglichen. Es wurden3insgesamt 60 Gene ermittelt, die unterschiedlich exprimiert waren (≥2-facher Unterschiedund p<0.05 (FDR korrigiert)), und zwei Kandidaten (TPSI1 und AP1µ1 ) konnten alsZielgene von Ls besta¨tigt werden. Anhand von RNA-Seq and real-time PCR Analysenkonnte eine 2- bis 5-fache Hochregulierung von TPSI1 in ls-1 ermittelt werden, einem Gen,welches unter Phosphatmange induziert wird. RNA in-situ Hybridisierungen zeigten, dasssich TPSI1 Transkripte in Blattachseln von ls-1 anha¨ufen, jedoch nicht im Wildtyp. Diesdeutet an, dass Ls die Transkription von TPSI1 in Blattachseln unterdru¨ckt. Im Gegen-satz dazu steht AP1µ1, welches von Ls aktiviert wird. Die Expression von AP1µ1 war5-7fach niedriger in ls-1 als im Wildtyp, was in RNA-Seq und real-time PCR Experi-menten gezeigt wurde. RNA in-situ Hybridisierungen zeigten, dass AP1µ1 spezifisch inBlattachseln exprimiert ist, an Positionen, an denen sich spa¨ter Achselmeristeme bilden.AP1µ1 ist eine Untereinheit des Adapterproteinkomplexes 1 und wird fu¨r den vesikula¨renTransport beno¨tigt, um Clathrin mit Cargomoleku¨len zu verbinden, eine Funktion, dieaus Studien an Tieren bekannt ist. Eine mo¨gliche Funktion von AP1µ1 in der Bildungvon Achselmeristemen wird in dieser Arbeit diskutiert.Der Tomaten Traskriptionsfaktor Goblet (Gob), das einzige orthologe Gen zu CUP-SHAPED COTYLEDON1 (CUC1 ) und CUC2 in Arabidopsis, zeigt eine sehr a¨hnlichesgrenzschichtenspezifisches Expressionsmuster in Achseln von Blattprimordien wie das LsGen. Um herauszufinden, ob Gob und Ls im gleichen Signalweg agieren und in welcherHierarchie, wurden Expressionsanalysen in der gob-3 Mutante mittels qRT-PCR durch-gefu¨hrt. Dabei wurde eine geringere Expression von Ls in gob-3 ermittelt. Im Ver-gleich zum Wildtyp wurde zusa¨tzlich eine verringerte Expression von AP1µ1 sowie eineErho¨hung der Expression von TPSI1 in gob-3 beobachtet. Diese Ergebnisse deuten an,dass Ls sowie dessen Zielgene von Gob reguliert werden.4

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