research
Genetic defects in patients with mitochondrial encephalomyopathies
- Publication date
- 20 May 2005
- Publisher
- Dit proefschrift is een bijdrage aan het snel groeiende kennisgebied gewijd aan de verbetering van de diagnostiek op DNA-niveau bij patiënten met mitochondriële encephalomyopathieën en is onder andere geïnspireerd door de hypothese van de communicatie over en weer tussen het kerngenoom (bijv. de 24 kDA subunit van complex I) en het mitochondriële genoom. Het presenteert de resultaten van klinische, biochemische en moleculair-genetische studies die uitgevoerd zijn op de Afdeling Humane Genetica, St.-Radboud Ziekenhuis Nijmegen; op de afdeling Genetica, Universiteit Maastricht; op de afdeling Neurologie, Erasmus MC Universitair Medisch Centrum Rotterdam, en in het Institute of Neurology, The National Hospital, Queen Square, Londen, Engeland (Introductie, hoofdstuk 1).
In dit proefschrift worden verschillende strategieën beschreven om de oorzaak van een mitochondriële encephalomyopathie of in het mitochondriële of in het kerngenoom te localiseren (hoofdstukken 2-7).
Eerst wordt een PCR-test beschreven om het spectrum van grote deleties van het mtDNA, zoals gevonden kan worden bij patiënten met een progressieve externe ophthalmoplegie of het Kearns-Sayre syndroom, aan te tonen. Het voordeel van deze, op een PCR gebaseerde test in vergelijking met de ‘Southern blotting’-techniek is de gevoeligheid van deze methode om deleties te detecteren. In veel gevallen is het DNA dat uit bloedleukocyten of uit haarwortels van de patiënt is verkregen, voldoende voor het stellen van de diagnose. Hierdoor kan de patiënt een spierbiopt worden bespaard (hoofdstuk 2).
Met een ontwikkelde ‘single stranded conformation polymorfism’ (SSCP) analysemethode voor mitochondriële tRNA-mutaties is bij een patiënt met het klinische beeld van een mitochondriële encephalopathie met lactaatacidose en herseninfarctachtige episoden (MELAS-fenotype), een mutatie in het tRNAVal gen (G1642A) gevonden. Deze mutatie is eenmaal eerder gerapporteerd. Onze observatie is onafhankelijk van de eerdere rapportage gedaan. Het fenotype van onze patiënt is gelijk aan die van de eerdere, hetgeen de pathogeniciteit van deze mutatie waarschijnlijk maakt. Het fenotype van onze patiënt verschilt van andere MELAS-patiënten door de afsluiting van kleine cerebrale corticale arteriën. Betrokkenheid hiervan is niet eerder gerapporteerd (hoofdstuk 3).
SAMENVATTING 191
Vervolgens wordt de analyse op mutaties in het enige mitochondrieel gecodeerde complex III-gen, het Cytochroom b-gen, bij vijf geïdentificeerde patiënten met een biochemisch fenotype van een complex III-defi-ciëntie weergegeven. Bij een patiënt wordt een vier base paar deletiemutatie gevonden op positie 14787 en een homoplasmisch polymorfisme. De mutatie is heteroplasmisch en is aanwezig in 95% in spier. Bij de klinisch gezonde moeder is geen mutatie vastgesteld. Deze ‘frameshift’-mutatie zal zeer waarschijnlijk zorgen voor een verstoring van de synthese van het cytochroom b-eiwit. Het fenotype van de patiënt is een overlappend beeld van Parkinsonisme en MELAS, wat niet eerder is beschreven noch geassocieerd met een complex III-deficiëntie, noch met een mutatie in het Cytochroom b-gen. Bij twee van de vier andere patiënten heeft de mutatieanalyse twee verschillende homoplasmische polymorfismen opgeleverd. Bij deze vier patiënten is geen mutatie gevonden. (hoofdstuk 4).
Bij een patiënt met symptomen zoals gezien bij patiënten met een Leigh syndroom, wordt een de novo ontstane T8993C mitochondriële mutatie gerapporteerd. Hypothesen worden geformuleerd om deze de novogebeurtenis te verklaren en de stijging in mutatiepercentage van 0% bij het DNA in spier van de moeder naar 79% in spier van de patiënt. Kern gecodeerde, modificerende genen zijn waarschijnlijk nodig om het hoge percentage heteroplasmie van deze mutatie te begrijpen (hoofdstuk 5).
Hierna wordt het gebruik van de ‘denaturing high performance liquid chromatography’ (DHPLC) technologie getoond als een antwoord op het toenemende aantal verschillende testen om alle mogelijke mtDNA-muta-ties uit te sluiten. De DHPLC-methode is een snelle, betrouwbare en gevoelige methode om heteroduplexen te detecteren die resulteren van heteroplasmische DNA-strengen. Deze methode is bij uitstek geschikt voor mutatiedetectie van mtDNA, daar de meeste mutaties in dit DNA heteroplasmisch zijn. Een mtDNA-DHPLC protocol dat het mogelijk maakt om binnen een dag een complete mtDNA-mutatieanalyse te doen, is ontwikkeld. Een minimaal heteroplasmieniveau van 0,5% voor de A8344G-mutatie is gedetecteerd. Bij drie van de eerste zes mitochondriële encephalomyopathiepatiënten die gescreend werden met deze methode, is een mutatie aangetoond. Het uitsluiten van betrokkenheid van mtDNAmutaties ondersteunt het doen van een vervolgonderzoek naar kerngenen en heeft belangrijke implicaties voor genetisch advies (hoofdstuk 6).
Er zijn slechts enkele therapeutische mogelijkheden voor patiënten met mitochondriële encephalomyopathieën. In geval van een mtDNA-mutatie
192 SAMENVATTING
als de oorzakelijke factor voor ziekte zijn de mogelijkheden voor prenatale diagnose beperkt vanwege de gecompliceerde manier waarop de mutatie wordt overgedragen. Voor de eerste keer wordt een prenatale diagnose en bevinding van een mutatieoverdracht gerapporteerd bij een familie met de T9176C (ATPase6-gen)-mutatie (hoofdstuk 7).
Vervolgens wordt de karakterisering en mutatiescreening van de drie flavoproteïnen fractiegenen, de NDUFV1, NDUFV2, NDUFV3 genen, van complex I gegeven. Met behulp van chaotrope agentia kan complex I in drie fracties worden verdeeld. Een van de fracties, de flavoproteïnenfractie, bestaat uit drie subunits van 51, 24 en 10 kDa en is functioneel belangrijk voor complex I (hoofdstuk 8-11).
Eerst is de klonering en genomische localisering van de kleinste van de drie subunits, de NDUFV3 of 10 kDa gen, beschreven. De menselijke cDNA-sequentie is opgehelderd met behulp van een menselijke nier cDNA-bibliotheek met runder 10kDa cDNA met bekende sequentie. Het 5' einde van het cDNA is verkregen met de snelle vermenigvuldigingsprocedure van cDNA-einden (RACE). Northern blot toonde aan dat het gen algemeen tot expressie komt. Het gen bevat drie exonen en bestrijkt ongeveer 20kb. Een Southern blot-procedure met een set humane/hamster somatische celhybriden toont dat het gen is gelocaliseerd op chromosoom
21. Een 10-kDa gen bevattende cosmide is verkregen van een chromosoom 21-specifieke cosmidenbibliotheek en gebruikt voor een fluorescentie in situ hybridisatie (Fish) procedure ter verfijning van de chromosoom 21-locatie naar een gebied beperkt tot 21q22.3 (hoofdstuk 8).
Hierna wordt de klonering en karakterisering van het Fe-S cluster bevattende 24 kDa subunit gen beschreven. Het homologe runder 24 kDa cDNA is gebruikt om een humane cosmidenbibliotheek te screenen. De zoektocht is gecompliceerd geweest door de aanwezigheid van een pseudogen. De 24 kDa cDNA cosmiden zijn in kaart gebracht door het analyseren van de gebieden van hybridisatie met een Southern blot-panel met humane/ham-ster somatische celhybriden. Deze analyse verwijst naar twee genen. Een groot fragment is gelocaliseerd op chromosoom 19 en drie kleinere fragmenten op chromosoom 18. Verdere verfijning van de localisatie is verricht met chromosoomspecifieke somatische celhybriden voor chromosoom 18- en 19-fragmenten. Met deze procedure is het locus toegewezen aan 18p11.2-pter en aan chromosoom 19q13.3-qter. In een Fish-procedu-re zijn de loci verder verfijnd naar 18p11.2-11.31 en 19qter. De twee genen zijn gesequenced en onthullen dat de chromosoom 19 locus een
SAMENVATTING 193
pseudogen representeert en de chromosoom 18 locus het actieve 24 kDa gen. De Northern blot toont een algemeen voorkomende genexpressie (hoofdstuk 9).
Verder wordt de structuur van het NDUFV1-gen, coderend voor de 51 kDa flavoproteïne subunit van complex I, beschreven. De structuur van het gen is opgehelderd met behulp van de bekende runder 51kDa cDNA-sequen-tie. Met primers afgeleid van het cDNA, zijn PCR-fragmenten van genomisch DNA gegenereerd. Het gen blijkt 10 exonen te bevatten die coderen voor 464 aminozuren en strekt zich uit over 5kb. De Northern blot-analy-se toont algemene expressie die het hoogste is in de pancreas. Voor testis mRNA is een uniek mRNA lengtefragment aanwezig (hoofdstuk 10).
Vervolgens wordt de mutatieanalyse voor de drie flavoproteïnen subunits, namelijk de genen NDUFV1, NDUFV2 en NDUFV3, beschreven. Voor deze mutatieanalyse zijn 20 patiënten met een mitochondriële encephalomyopathie en een geïsoleerde complex I-deficiëntie geselecteerd. Er zijn geen mutaties in deze groep patiënten gevonden. Drie polymorfismen zijn gevonden in het NDUFV2-gen. Deze studie ondersteunt het idee dat de flavoproteïnenfractie van complex I geen ‘hotspot’ is voor mutaties (hoofdstuk 11).
Tot slot worden de nieuwe bevindingen, gepresenteerd in dit proefschrift, in perspectief gezet en aanwijzingen voor toekomstig onderzoek bediscussieerd (hoofdstuk 12).