MATOS, A.

OLIVEIRA, E. M. M.

SILVA, R. M. da

Infoteca-e

Uso de PCR em Tempo Realcomo Ferramenta para Garantira Autenticidade de AlimentosProcessados à Base de Mamão(Carica papaya)148ISSN 0103-5231Dezembro, 2009Rio de Janeiro, RJMinistério da Agricultura,Pecuária e AbastecimentoEdna Maria Morais Oliveira1Andrea Matos2Roberta Manhães da Silva3IntroduçãoO mamoeiro (Carica papaya L.), da família Caricaceae,é uma das fruteiras mais cultivadas e consumidas nasregiões tropicais e subtropicais do mundo. É originárioda América Tropical, entre o noroeste da América doSul e o Sul do México.  O Brasil é o maior produtormundial desta fruta, com produção de um milhão e890 mil toneladas no ano de 2007, segundo dados daFAO – Organização das Nações Unidas para aAlimentação e a Agricultura (FOOD ANDAGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITEDNATIONS, 2007). Isto representa 27% da produçãodo mundo neste ano. Embora seja o maior exportadormundial de mamão, seguido pelo México, o Brasilexporta mais mamão do grupo Solo, enquanto oMéxico produz mais do grupo Formosa. Para aumentara disponibilidade e o consumo, muitos produtosprocessados à base de mamão têm sido desenvolvidoscomo barras de cereal, iogurtes, bebidas lácteas,bebidas de soja, entre outros (LÓPEZ-MALO et al.,1994). O mesocarpo do mamão, a polpa, é a parte dafruta utilizada nos produtos processados. Sendo assim,o uso de técnicas moleculares torna-se uma importanteferramenta para a detecção da presença de mamãonesses produtos, contribuindo para o controle daqualidade e a autenticidade de tais produtos. Paratanto, o gene endógeno do mamão que codifica apapaína, pode ser usado como marcador molecularpara garantir a presença de mamão na composição detais produtos.Assim, objetivo deste trabalho foi verificar a presençade mamão em produtos industrializados por detecção equantificação do gene para papaína, um geneendógeno e específico para mamão. Taisdeterminações foram conduzidas por PCR convencionale em tempo real, usando o sistema SYBR Green para aquantificação (PCR em tempo real).1Engenheira Química, D.Sc. em Bioquímica, pesquisadora da Embrapa Agroindústria de Alimentos, Rio de Janeiro,RJ, edna@ctaa.embrapa.br2Química, analista da Embrapa Agroindústria de Alimentos, Rio de Janeiro, RJ, andreams@ctaa.embrapa.br3Nutricionista, M.Sc. em Nutrição, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ,betanutry@gmail.com2 Uso de PCR em Tempo Real como Ferramenta para Garantir a Autenticidade de Alimentos Processados à Base de Mamão (Carica papaya)PCR quantitativoPara determinação do conteúdo de mamão nasamostras de produtos processados, foram conduzidasPCR em tempo real no equipamento ABI7000 SDS(Applied Biosystems), cujas condições foramestabelecidas como:10 mL de 1x TaqMan UniversalMastermix (Applied Biosystems), 2 mL  de cada primer(2.5 nmol/L ), 1 mL de 20x SYBR GREEN e  5 mL deDNA, com volume final de 20mL. As condições determociclagem foram as seguintes: 95°C por 10 min;40 ciclos de 95°C por 15s e 65°C por 1 min,acrescido de uma etapa para construção da curva dedissociação. Todas as reações foram realizadas emtriplicata.Resultados e DiscussãoO isolamento do DNA foi uma etapa bem sucedidapara todas as amostras, embora algumas das amostrasde DNA não tenham sido vizualizadas  no gel deagarose. Isso se deve ao alto grau de processamentodos alimentos e, portanto, alta degradabilidade e baixaconcentração do DNA, Em experimentos anteriores(PERON et al., 2007)., foi possível mostrar aamplificabilidade do DNA isolado, mesmo em baixasconcentrações e com alto grau de desnaturação,através da condução de PCR qualitativo.A curva padrão construída com amostras obtidas pordiluição seriada do DNA isolado da polpa de mamãoestáo apresentada na Figura 1. O PCR quantitativo foiconduzido usando o gene para papaína (“house-keepinggene”). A inclinação e o coeficiente de correlação daretas obtidas foi de -3,83 e 0,97, respectivamente.Assim sendo, estes dados podem ser consideradospromissores. A concentração mais alta de papaínausada para quantificação desses produtos tambémcontribuiu para um R2 baixo, como conseqüência damenor eficiência da reação. Isso porque os primersencontram mais dificuldade em se ligar às seqüênciasespecíficas, diminuindo a ação da enzima (Taq DNApolimerase) na amplificação. A eficiência da PCRquantitativa (em tempo real) foi de 82,27 %, o Limiteda Detenção (LOD) foi de 3.6 e o Limite daQuantificação (LOQ) foi igual a 12. Quando essesvalores são comparados com o estabelecido emprotocolos de validação na análise de OGM (BARROS;OLIVEIRA; MARIN, 2008; CANKAR et al., 2006;EUROPEAN COMMISSION, 2007), fica evidente queessa ferramenta molecular tem potencial de aplicaçãopara o controle de qualidade na indústria de alimentos.Apesar da detecção de mamão em todas as amostras(Tabela 1), a quantificação não foi muito acurada,devido à quantificação abaixo do LOQ. Assim, osresultados foram estimados como sendo menores que1,3%.Tabela 1. Quantidade de DNA de mamão nos produtosprocessados.PRODUTO MAMÃOIogurte >1.3%Alimento infantil >1.3%Bebida Láctea* >LOD*O LOD do método quando expressoem massa/quantidade é de 0,8 pg.Material e MétodosAmostrasAmostras de polpa de mamão foram obtidas pelodespolpamento de frutos inteiros e usadas para aconstrução da curva padrão. Os frutos e os produtosprocessados foram adquiridos em mercados locais(mamão, iogurte, alimento infantil e bebida láctea).Extração e quantificação de DNAO DNA genômico de todas as amostras foi isoladousando 50 mg de cada amostra, seguindo o protocolodo kit comercial DneasyÒ (Quiagen). As amostrasforam homogeneizadas em blender (Poli Skymsen)antes do procedimento de extração. O DNA genômicofoi quantificado por espectrometria a 260nm (Biorad-Spectrophotometer).Desenho de primersOs primers, sintetizados pela MWG Biotech, foramdesenhados usando o Software Primer Express1.2 forMacintosh, e as seqüências do gene para papaínadepositadas no GenBank (Accesso K00821 eM30884). y = -3,8357x + 23,984R2 = 0,9661202122232425262728-0,5 0 0,5 1Log of template amount ( ? g)CtFigura 1. Eficiência da PCR quantitativa usando DNAisolado da polpa de mamão.Esses resultados foram obtidos com um materialcomum, pois não há material certificado ou dereferência para a grande maioria dos vegetais, que nãoestão relacionados a produtos geneticamentemodificados.3Uso de PCR em Tempo Real como Ferramenta para Garantir a Autenticidade de Alimentos Processados à Base de Mamão (Carica papaya)Exemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa Agroindústria de AlimentosEndereço: Av. das Américas, 29.501 - Guaratiba                23020-470  -  Rio de Janeiro  -  RJFone: (0XX21) 3622-9600Fax: (0XX21) 2410-1090 / 2410-9713Home Page:  http:\\www.ctaa.embrapa.brE-mail:  sac@ctaa.embrapa.br1a edição1a impressão (2009): tiragem (50 exemplares)Presidente:  Virgínia Martins da MattaMembros:   Marcos José de Oliveira Fonseca, MaríliaPenteado Stephan, Renata Torrezan, Ronoel Luiz deO. Godoy, Nilvanete Reis Lima e André Luis doNascimento GomesSecretária:  Michele Belas CoutinhoSupervisor editorial:  Comitê de PublicaçõesRevisão de texto: Edmar das Mercês PenhaNormatização bibliográfica: Luciana S. de AraújoEditoração eletrônica:  André Luis do N. Gomes eMarcos MoulinComitê depublicaçõesExpedienteComunicadoTécnico, 148Ministério da Agricultura,Pecuária e AbastecimentoCGPE 8224 Tm = 77oC25%2%Figura 2. Amplificação e curva de dissociação dasamostras de DNA isoladas de produtos a base de mamão.ReferênciasBARROS, N. E. F. de; OLIVEIRA, E. M. M.; MARIN, V.A. Applicability of the real-time polymerase chainreaction based-methods in quantification of geneticallymodified organisms in foods. Revista de Nutrição,Campinas, v. 21, n. 1, p. 85-92, jan./feb. 2008.CANKAR, K.; ŠTEBIH, D.; DREO,  T.; ZEL, J.;GRUDEN, K. Critical points of DNA quantification byreal-time PCR – effects of DNA extraction method andsample matrix on quantification of genetically modifiedorganisms. BMC Biotechnology, Londres, v. 6, p. 37,2006.EUROPEAN COMMISSION. Joint  Research Centre.Event-specific method for the quantification ofsoybean line A2704-12 using  real-time PCR. 2007.Disponível em: <http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/A2704-12_soybean_validated_Method.pdf>. Acesso em: 15out. 2009.FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THEUNITED NATIONS. FAOSTAT. 2007. DisponíveL em:<http://faostat.fao.org/>. Acesso em: 15 out. 2009.LÓPEZ-MALO, A.; PALOU, E.; WELTI, J.; CORTE, P.;ARGAIZ, A. Shelf-stable high moisture papayaminimally processed by combined methods. FoodResearch International, Toronto, v. 27, n. 6, p. 545-553, 1994.PERON, F. N; MATOS, A.; OLIVEIRA, E. M. M.;BARROS, N. E. F.; BATICUCCI, M. C. P.; FONSECA,M. J. O.; FREITAS-SILVA, O. Uso de ferramentasmoleculares para garantia da qualidade de alimentosproduzidos à base de mamão. Alimentos Ciencia eIngeniería, v. 16, n. 3, 2007. p. 25-26. Edição dostrabajos aceptados para su presentación en VICongreso Iberoamericano de Ingeniería en Alimentos,Ambato, Equador, nov. 2007.As curvas de dissociação indicaram que as condiçõesda PCR em tempo real devem ser otimizadas parareduzir a formação de dímeros de primers (Figura 2).Esta avaliação é muito importante, pois estes ensaiosforam realizados para a obtenção de um produto dePCR pequeno para permitir a detenção. Contudo,houve uma redução na sensibilidade, o que éinteressante para conduzir a reação em condiçõesótimas. Para todas as amplificações, a temperatura demelting (Tm) dos produtos da PCR foi de 77oC, e odesvio padrão foi igual a zero, mostrando a altaespecificidade dos primers usadosEsses resultados confirmam a aplicabilidade demétodos baseados na técnica PCR para garantir aautenticidade e a qualidade dos produtos a base demamão, permitindo avaliar se os produtos atendem àsdeterminações da legislação de rotulagem e aosdireitos de consumidores.

Uso de PCR em tempo real como ferramenta para garantir a autenticidade de alimentos processados à base de mamão (Carica papaya).

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Uso de PCR em tempo real como ferramenta para garantir a autenticidade de alimentos processados à base de mamão (Carica papaya).

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