福山 圭

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博士学位論文の要旨及び審査結果の要旨 (Summary of Thesis(DR))othe

福山, 圭

Tohoku University Repository (TOUR) / 東北大学機関リポジトリ

薬理活性を有するC4-四置換型ヌクレオシド誘導体の効率的合成法の開発著者 福山 圭号 52学位授与機関 Tohoku University学位授与番号 農博第1158号URL http://hdl.handle.net/10097/00122791ふくやま けい氏 名 （ 本 籍 地 ） 福 山 圭学 位 の 種 類 博士（農学）学 位 記 番 号 農博第 1158 号 学 位 授 与 年 月 日 平成 28 年 3 月 25 日 学 位 授 与 の 要 件 学位規則第４条第１項研 究 科 ， 専 攻 東北大学大学院農学研究科（博士課程）生物産業創成科学専攻論 文 題 目 薬理活性を有する C4-四置換型ヌクレオシド誘導体の効率的合成法の開発 博士論文審査委員 （主査）教 授 桑原 重文教 授 山下 まり准教授 仲川 清隆准教授 不破 春彦464 論文要旨      薬理活性を有する C4-四置換型ヌクレオシド誘導体の 効率的合成法の開発     東北大学大学院農学研究科 生物産業創成科学専攻 生物有機化学分野   福山 圭    指導教員 桑原 重文 教授    465 １序   フレミングによる 1928 年のペニシリンの発見に端を発する抗生物質の開発・供給は，人々の細菌感染症による死亡率を大きく低下させることに貢献してきたが，近年大きな社会問題となっている感染症は，鳥インフルエンザ，エイズ，エボラ出血熱などウイルスによるものが多い。それらのウイルスは遺伝子変異による強毒性化や薬剤耐性の獲得などにより，人類に対する脅威を深刻化させており，それらに対抗する新たな医薬品の創製は現代医療における喫緊の課題と言えよう。 本博士論文では，修飾ヌクレオシド構造を有する抗エイズウイルス候補薬 EFdA（4’-ethynyl-2-fluoro-2’-deoxyadenosine）の効率的全合成法の確立と，その研究過程で見出した新規 C4-四置換型フラノース誘導体を用いた架橋化核酸（bridged nucleic acid：BNA）単量体の単段階合成について研究を行った。第１章では，EFdA 合成の鍵となる新規 C4-四置換型フラノース誘導体の創製と、それを用いた EFdA の高収率全合成ルートの開拓について記述した。第２章では，核酸医薬品としての期待が高まっている BNA の単量体合成における新規 C4-四置換型フラノース誘導体の適用について述べた。   第１章 抗 HIV 活性を有するヌクレオシド誘導体 EFdA の合成研究  EFdA（1）は東北大学名誉教授（現横浜薬科大教授）の大類洋らにより設計・合成されたヌクレオシド型逆転写酵素阻害剤である（Figure 1）1)。その特徴として①既存臨床薬の数万倍から数百倍の増殖阻害活性を持つ [EC50 (HIV-1NL4-3), 50 pM]、②急性毒性を示さない (ICR マウス, 100 mg/kg p.o.)、③長い血中半減期 (t1/2, 17.2 h)、④薬剤耐性を含む各種 HIV に有効、など抗 HIV 薬として望ましい特性を備えている。一方，本化合物の臨床開発における最大のネックは 1 の供給体制が十分でない点にある。既存の２つの合成法 (大類法 1a, 2)，桑原法 3)）が知られているものの（Scheme 1），原料価格，収率，立体選択性の点で問題を残していた。この様な背景の下，著者は真に実用的な EFdA 合成法の開発研究を行った          OHOHONNNNNH2FEFdA (1)Figure 1. Structure of EFdA (1).24'Scheme 1. Previous syntheses of EFdAOHOHONNNNNH2FEFdA (1)OHOHONNNNNH2NH2expensiveCHOOO18 steps2.3%long stepslow yieldOhrui et al.12 steps18%modest stereoselectivityKuwahara et al.2 3466 ２1-1. 新規 C4-四置換型フラノース誘導体の創製研究  EFdAの合成における最大の課題は，C4’位の四置換不斉炭素を如何にして構築するかである。フラノース誘導体の 4 位に炭素置換基を導入して四置換炭素とする方法としては，安価で大量に入手可能な diacetone-D-glucose (4)から 5 工程で得られる 5-オキソペントフラノース誘導体 5 を aldol–Cannizzaro 反応により 4-ヒドロキシメチル化して 6 を得る Moffatt らの方法が唯一の報告例であったが 4)，生成する 2 つの水酸基の選択的保護に問題があった（Scheme 2）。 そこで，4 の Nor-AZADO 酸化で定量的に得られる 3-ケトフラノース誘導体 8 とパラホルムアルデヒドとのアルドール反応について検討した結果，K2CO3 や Et3N を塩基として用いると，4 位の立体化学の反転を伴って，アルドール反応生成物 9 とそれがホルムアルデヒドと過剰反応を起こして環化した 10 の混合物が定量的に得られることを見出した（Scheme 3, Table 1）。10 は報告例の少ないアセタール/ヘミアセタール連続構造を持つ新規糖誘導体であり，還元処理により 9 とともにアルコール 11 へと立体選択的に変換できた（アルドール反応完結後，濾過により塩基を除去し，濾液に水と NaBH4 を加えることで簡便に C4-四置換炭素を持つ 11 を得る手法を確立した；白色結晶，100 g スケール，4 から 3 工程，通算収率 93%）。以下に述べるように，11の 3 位，5 位および 5’, 6’位は選択的な修飾が可能であり，自由度の高い新規な四置換炭素含有合成ユニットになり得るものと考えている。  OOOOHCHBnOOOOHOBnOHOaq. CH2ONaOHH2Oaldol‐Cannizzaroreaction5 6OHOOHO OO45 stepsScheme 2. Moffatt's 4-hydroxymethylation of 5-oxo pentofuranose5 55'NaHBnBr OOOR1OBnOR2O7a: R1 = Bn, R2 = H7b: R1 = H, R2 = Bn7c: R1 = Bn, R2 = Bn55'modestselectivityOHOOO OONor-AZADO(0.005 mol%)NaClO, KBraq. NaHCO3CH2Cl20 oC, 25 minOHOO OO+OOH OOOOOOOOca. 3:1489 10filtration then H2ONaBH4, 0 oC, 30 minOHOOH OOOO113 steps93%  yield by trituration(100 g scale)cf. Table 1(CH2O)n355'6THFrtScheme 3. 4-Hydroxymethylation of 3-keto furanoseEntry base (eq.) temp. yield (11, %)4Et3N (4.0)reaction time70 oC quant.K2CO3 (2.0) rta) 1.0 mmol scale; b) 3-steps isolated yield; c) 100 g scale, reaction time 4 h.b)30 min quant. (93%)30 mintrace1 h12 LDA (1.1) －78 to rt 40 min 763c)NaH (2.0) －78 to 0 oCa)Table 1467 ３1-2. 3 位および 5 位の水酸基の保護と 5’,6’-部位の変換  EFdA の全合成には直接的な関係はないが，11 の新規四置換炭素含有合成ユニットとしての有用性を示すために，11 の 2 つの水酸基（3 位と 5 位）の選択的保護を検討した（Table 2）。Entry 5 に示すように，両水酸基の選択的保護が可能であった。EFdA の合成については，Entry 2 で得たジベンジル保護体 12b を用いて研究を進めた。12b はヨウ素存在下NaIO4 で処理すると，5’, 6’位アセトナイドの選択的脱保護と酸化開裂が一挙に起こり，13 を定量的に与えることを見出した（Scheme 4）5)。一方，シリル保護体 12e を H5IO6で処理するとジアステレオマー混合物 15 が得られた。これは，脱保護と酸化開裂により 14 が生成し，retroaldol 反応による開環と aldol 反応による再閉環が起こった結果であると考えている。  1-3. アセチレン部位の構築とβ選択的 N-グリコシル化   アルデヒド 13 を Corey−Fuchs 法により保護アルキン体 17 へと導いた（11 より 4 工程, 88%）（Scheme 5）。17 のアセトナイドを脱保護して 18 とした後，アセチル化によりジアセテート 19 を得た。19 を Vorbrüggen 条件 6)（2-fluoroadenine (20)/BSA/TMSOTf）を用いて N-グリコシル化したところ，21 と 22 の位置異性体混合物 (1:1) が得られた。そこで Vorbrüggen 変法 7) (20/DBU/TMSOTf) を適用したところ，反応は位置選択的かつ立体選択的に進行し，目的とするヌクレオシド誘導体 21 のみを定量的に得ることが出来た。21 をメタノリシスにより脱アセチル化してアルコール 23 に変換した（17より 4 工程，75%）。    Entry reagent (eq.) temp. yield (%)1time23quant.30 minBnBr (2.2)quant.refluxsolventTHFBnR2PMBPMBCl (2.2)THF reflux 30 min45BzCl (2.2) Py. rtBnR1PMB30 min 81BzBzTBDPSCl (1.2)quant.TBDPS TBS30 minthen30 minDMFbase (eq.)NaH (2.5)NaH (2.5)imid. (2.5)thenTBSCl  (1.2)TBSCl  (3.0) quant.TBS TBSDMF 30 minimid. (2.5) rtrtproduct12a12b12c12d12e－OHOOH OOOO11OR1OOR2 OOOO12a-e35Table 2. Protection of the hydroxy groups at the C3 and C5 positions.355'OBnOOBn OO355'OBnOOBn OO13OI2, NaIO4aq. MeCN70 oC, 2 hOO12b355'OTBDPSOOH OO14O12e retroaldol& aldolH5IO6EtOAc355'OTBDPSOOH OO15OScheme 4. Oxidative cleavage of acetonide 12b468 ４               1-4. 2’-脱酸素化と脱保護による EFdA (1)の全合成の完成   23 に対する Barton−McCombie 法による 2’-脱酸素化 8)を検討した。まず，THF 中，23 を 1,1'-チオカルボニルジイミダゾールを用いて 24 に変換し，粗生成物のトルエン溶液に Bu3SnH とラジカル開始剤（AIBN）を室温で加えた後に還流したところ，高収率で 23 が再生する結果となった（Scheme 6 参照）。一方，24 のトルエン溶液に，還流しながら Bu3SnH と AIBN のトルエン溶液を加えたところ，目的とする 2’-デオキシ体 25 が 77%（2 工程）の収率で得られた。最終的には，Scheme 6 に示す通り，23 をトルエン中，室温で 24 に変換した後，その反応溶液を還流しながら Bu3SnH と AIBNのトルエン溶液を滴下したところ，23 からワンポット，98%の高収率で 25 を得ることに成功した。25のシリル保護基をTBAF で除去して26 とした後，２つの ベ ン ジ ル 基 をBirch 還元で除去すことにより，EFdA（1）の全合成を完了した 9)。合成した1 の各種スベクトルは標品のものと良い一致を示した。   Scheme 6. Completion of the synthesis of  EFdA (1)23N NSNNOBnOBnO O24TESNNNNNH2Ftoluenert, 30 minBu3SnHAIBNtoluenereflux, 30 min(one pot)98%SNNOBnOBnO25TESNNNNNH2FTBAF, THFrt, 30 minOBnOBnO26NNNNNH2F Na, liq. NH3－78 oC, 10 min61% from 22OHOHOEFdA (1)NNNNNH2FOBnOBnO OOCBr4PPh3CH2Cl20 oC1 hn-BuLiTHFthenTESClBr2C16Scheme 5. Conversion of aldehyde 13 into ribonucleoside derivarive 23.OBnOBnO OHOH18aq. AcOH100 oC1h13TESOBnOBnO OO17TES88% from 11OBnOBnO OAcOAc19Ac2O, Py.rt, 1hTESOBnOBnO OAc2120, BSATMSOTfClCH2CH2Clreflux, 4 h60% TESNNNNNH2FNHNNNNH2F20OBnOBnO OAc22TESNNNN FNH2+21/22 = 1:1OBnOBnO OH2320, DBUTMSOTfMeCN60 oC, 30 minquant. TESNNNNNH2F2175%, from 17MeOH, Et3Nreflux, 18 h469 ５第 2 章 架橋化核酸単量体の合成研究   架橋化核酸（bridged nucleic acid: BNA）は，糖部位に架橋構造を有するヌクレオチド鎖である10)。その内Figure 2 に示した 2’,4’-BNA モノマーを構成糖として含む 2’,4’-BNA は，フラノース環部位のコンホーメーションが N-typeに固定されることで相補的ヌクレオチド鎖に対する結合力が格段に増大するとともに，架橋部位の立体的かさ高さによりヌクレアーゼに対する分解抵抗性も向上することが知られており，主にアンチセンス法に基づく核酸医薬としての応用が期待されている11)。 2’,4’-BNA モノマーの合成に関しては，Moffatt 法によりその C4’-四置換炭素の構築が行われているため，大類らの EFdA 合成と同様に生成する２つの水酸基の反応選択性が問題となっていた。そこで著者は，新たに見出した新規 C4-四置換型フラノース誘導体 11 を用いた BNA 単量体の効率的合成法の確立を目的として，以下の研究を行った。   2-1.  核酸塩基導入前駆体 29 の調製   12b の酸化開裂で得たアルデヒド 13 （Scheme 4 参照）をエタノール溶媒中、NaBH4 で還元することにより，5’-アルコール 27 を定量的に得た（Scheme 7）。収率の向上と操作性の向上を目的に 12b から 27 へのワンポット変換を検討したが，12b を I2 (cat.)/NaIO4/aq. MeCN 条件により 13 とした後，反応液に 30 w/v チオ硫酸ナトリウム水溶液と NaBH4を加える方法を試みたものの，27 の単離収率は 75%に留まった。27 をトシル化した後，アセトナイドの脱保護とアセチル化をワンポットで行い，核酸塩基導入前駆体であるジアセテート体 29 へと誘導した。    2-2. Vorbrüggen 変法による核酸塩基部位の導入の検討   これまでに報告された 2’,4’-BNA モノマーの合成では，核酸塩基（あるいはその保護体）の導入には Vorbrüggen 条件（核酸塩基/BSA/TMSOTf）が用いられており，第１章の EFdA の合成の際に好結果が得れた Vorbrüggen 変法（核酸塩基/DBU/ TMSOTf）を適用した例は見当たらなかった。そこで，Vorbrüggen 変法による核酸塩基部位の導入の検討を行った（Table 3）。ジアセテート体 29 に対しアデニン（A）、6N–ベンゾイOOHOHOBase2', 4'-BNA monomersFigure 2. Structure of 2',4'-BNA monomers2'4'OBnOBnO OO13ONaBH4EtOH0 oC30 minOBnOBnO OO27HOquant. (2 steps)75% (one pot)Py., rt4h, 88%OBnOBnO OO28TsOTsClAc2Oconc. H2SO4 (cat.) OBnOBnO OAcOAc29TsOAcOH, rt99%Scheme 7. Preparation of N-glycosidation precursor 2912bI2NaIO4aq. MeCN470 ６ルアデニン（6N-Bz-A）、ウラシル（U）との N-グリコシル化を行ったところ，アデニンそのものに関しては 9N-グリコシル化が選択的に進行し，ヌクレオシド誘導体が高収率で得られた（Entry 1）。ところが、BNA を核酸自動合成装置で合成する際に実際に用いられる基質である 6N–ベンゾイル保護 BNA モノマーの調製を意図して 10)，6N-Bz-A による N-グリコシル化を試みたところ，目的物は低収率で得られるのみであった（Entry 2–4）。ウラシルの導入に関しては，目的物を得ることは出来なかった。  今後は Vorbrüggen 条件（核酸塩基/BSA/TMSOTf）による核酸塩基またはその保護体の導入を行った後，架橋部位の構築を行って 2’,4’-BNA モノマーの合成を目指す予定である。   総括   第１章では，安価な原料である diacetone-D-glucose (4)から 14 工程，通算収率 37％で EFdA (1)を得る合成ルートを確立した（Scheme 8）。本合成ルートでは，3-ケトフラノース誘導体 8 とパラホルムアルデヒドとのアルドール反応を経る新規 C4-四置換型フラノース誘導体 11 の創製に成功するとともに，アセトナイドのワンポットでの酸化開裂によるアルデヒドの調製（12b → 13），Barton−McCombie 法による 2’-脱酸素化のワンポット化（23 → 25）も実現した。ジアステレオマーが生じる可能性のある工程（8 → 11, 19 → 21）の立体選択性も完璧であり，従来法と比較して効率的で実用的な合成法を確立できたものと考える。  第２章では，新規 C4-四置換型フラノース誘導体 11 を用いた架橋化核酸単量体（2’,4’-BNA モノマー）の合成研究を行った（Scheme 9）。これまでの Moffatt 法による C4-四置換中間体の調製を経るルートに比べて，より簡便に塩基導入前駆体（29）を得ることが出来たと考えている。        OBnO OAcOAcBnOTsOOBnO OAcBnOTsOBasecf. Table29 30Table 3. Attempted N-glycosidation by the modified Vorbruggen reaction.NHNNNNHRNHNHOON6-Bz-A: R= BzUA: R= Hnucleobasebase (eq.) temp. yieldTMSOTf (eq.)Entry6.0 DBU (2.0) rt A 9012 6.0 rt N6-Bz-A 123 6.06.0DBU (2.0)Et3N (2.0)0 oC0 oCN6-Bz-AN6-Bz-A1525UU3.03.0DBU (1.5)Et3N (1.5)rt0 oCdecomp.N. R.a)456a) N. R .= no reaction－471 ７            引用文献 (1) a) Kohgo, S.; Ohrui, H.; Kodama, E.; Matsuoka, M.; Mitsuya, H. WO2005/090349; b) Ohrui, H. Chem. Rec. 2006, 6, 133−143; c) Ohrui, H. Proc. Jpn. Acad., Ser. B 2011, 87, 53−65. (2) Ohrui, H.; Hayakawa, H.; Kohgo, S.; Matsuoka, M.; Kodama, E.; Mitsuya, H. J.; Synth. Org. Chem. Jpn. 2006, 64, 716–723. (3) a) Kageyama, M.; Nagasawa, T.; Yoshida, M.; Ohrui, H.; Kuwahara, S.; Org. Lett. 2011, 13, 5264−5266.; b) Kageyama, M.; Miyagi, T.; Yoshida, M.; Nagasawa, T.; Ohrui, H.; Kuwahara, S.; Biosci. Biotechnol. Biochem. 2012, 76, 1219−1225. OHONNNNNH2FHOEFdA (1)OOOOOOH8OOOHOOOH4K2CO3(CH2O)nTHFOHOOOOHOO11OBnOOOOBnOO12bOBnOOOOBnOHC13I2, NaIO4 1) CBr4, Ph3P, THF2) n-BuLi, THF    then TESClOBnOOO17TESOBnOOAc19TESDBU, TMSOTfMeCN21O NNNNNH2FBnOTESNHNNNNH2F20OBn OBn OAcBnO OAc23O NNNNNH2FBnOTES BnO OH1) aq AcOH82% from 1175% from 17SN N NNthenn-Bu3SnH, AIBNtolueneOBnONNNNNH2FBnOTES251) TBAF, THF2) Ac2O, Pyaq MeCNMeOHEt3N2) Na, liq NH398%61%NaHBnBr93% from 4Scheme 8. Total synthesis of EFdA (1).filtration then NaBH4, H2ONor-AZADONaOClaq. NaHCO3CH2Cl2THFOBnOBnO OO13OOBnOBnO OO27HOquant. (2 steps)Py.88%OBnOBnO OO28TsOTsClAc2Oconc. H2SO4 (cat.)OBnOBnO OAcOAc29TsOAcOH99%NaBH4EtOHOHOOH OOBnBrNaHOO11Scheme 9. Preparation of N-glycosidation precursor 29 from 11OBnOOBn OOOO12bI2, NaIO4aq. MeCN70 oC, 2 hTHF472 ８(4) a) Youssefyeh, R. D.; Verheyden, J. P. H.; Moffatt, J. G.; J. Org. Chem. 1979, 44, 1301−1309.; b) Waga, T.; Nishizaki, T.; Miyakawa, I.; Ohrui, H.; Meguro, H.; Biosci. Biotechnol. Biochem. 1993, 57, 1433− 1438. (5) Yadav, J. S.; Satyanarayana, M.; Raghavendra, S.; Balanarsaiah, E.; Tetrahedron Lett. 2005, 46, 8745−8748. (6) a) Vorbrüggen, H.; Krolikiewicz, K.; Bennua, B. Chem. Ber. 1981, 114, 1234.; b) Vorbrüggen, H.; Höfle, G. Chem. Ber. 1981, 114, 1256. (7) Kristinsson, H.; Nebel, K.; O’Sullivan, A. C.; Struber, F.; Winkler, T.; Yamaguchi, Y.; Tetrahedron 1994, 50, 6825−6838. (8) Crich, D.; Quintero, L. Chem. Rev. 1989, 89, 1413−1432. (9) Fukuyama, K.; Ohrui, H.; Kuwahara, S. Org. Lett. 2015 17, 828–831. (10) a) Kaur H.; Babu B. R.; Maiti S. Chem. Rev. 2007, 107, 4672–4697.; b) Wengl L. Acc. Chem. Res. 1999, 32, 301–310. (11) a)小比賀聡 薬学雑誌 2000, 120, 147–158; b) 小比賀聡 薬学雑誌 2004, 124, 781–790. 473474

薬理活性を有するC4-四置換型ヌクレオシド誘導体の効率的合成法の開発

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