Doutoramento em BiologiaPermanece por esclarecer como a via de sinalização do cAMP modula a
exocitose regulada.
Os principais objetivos deste trabalho foram: i) avaliar o efeito do cAMP nos
eventos exocitóticos, nas propriedades dos poros de fusão e na secreção
hormonal; ii) perceber o impacto da sinalização por cAMP-HCN na exocitose e
nas propriedades do poro de fusão; e iii) estudar as propriedades do poro de
fusão na presença de um agente neurotóxico comum, como o alumínio.
Lactotrofos, isolados a partir da hipófise anterior de ratos Wistar machos,
foram usados como modelo celular. Os eventos unitários de fusão exocitótica e
a prolactina (PRL) libertada foram avaliados, respetivamente, em ensaios
eletrofisiológicos efectuados segundo a técnica de contacto hermético no
modo sobre a célula aderida à pipeta porta-elétrodo e com recurso a métodos
imunológicos de deteção. Os níveis intracelulares de cAMP foram aumentados
por 3-isobutil-1-metilxantina (IMBX), forscolina e N6,2'-O-dibutiril adenosina-
3',5'-monofosfato cíclico (dbcAMP). A expressão dos canais HCN foi
determinada por Western-blot, qRT-PCR e imunocitoquímica em combinação
com microscopia confocal. Culturas primárias de lactotrofos foram também
transfetadas com DNA plasmídico que codifica HCN2 juntamente com a
proteína-verde-fluorescente e um agente farmacológico foi usado para avaliar
o efeito de cAMP-HCN na exocitose.
Observou-se que os lactotrofos responderam à forscolina e ao dbcAMP
libertando PRL de um modo bifásico e dependente da concentração, uma vez
que a secreção aumentou e diminuiu, respectivamente, na gama de baixas e
altas concentrações. Os compostos que elevaram os níveis de cAMP
aumentaram os eventos transientes e impediram a fusão completa. Além
disso, o dbcAMP promoveu o aparecimento de eventos exocitóticos
transientes de elevada periodicidade, cujos poros de fusão, de maior diâmetro,
se mativeram abertos durante mais tempo. A expressão das quatro isoformas
de HCN foi confirmada nos lactotrofos ao nível do mRNA e, tal como no
coração, rim e hipófise, o mais abundante codifica a isoforma HCN2. Nos
lactotrofos com sobre-expressão desta isoforma, o dbcAMP não só aumentou
a frequência dos eventos transientes e a condutância dos poros, mas também
a frequência dos eventos de fusão completa. Enquanto o bloqueador dos
canais HCN, ZD7288, reduziu a frequência dos eventos transientes e de fusão
completa desencadeados por dbcAMP e diminuiu o diâmetro dos poros de
fusão. A simultânea diminuição da libertação de PRL, da frequência dos
eventos transientes e do diâmetro dos poros de fusão representaram as
principais alterações observados após pré-tratamento dos lactotrofos com
concentração micromolar de alumínio.
Em conclusão, os resultados demonstram que elevados níveis de cAMP
reduzem a secreção de PRL devido à estabilização dos poros de fusão no
estado de maior abertura. Além disso, a via de sinalização cAMP-HCN afecta a
actividade exocitótica e modifica as propriedades dos poros de fusão, que
parecem ser igualmente importantes na citotoxicidade induzida por alumínio.How the second messenger cAMP modulates regulated exocytosis is still
poorly understood.
The goals of this work were: i) to evaluate cAMP effect on single exocytotic
events, fusion pore properties and hormone release; ii) to assess the impact of
cAMP-HCN signaling on exocytosis and fusion pore properties; and iii) to study
fusion pore properties in the presence of a common neurotoxic agent, such as
aluminium.
Anterior pituitary lactotrophs isolated from male Wistar rats were used as the
cell model. Electrophysiology in cell attached patch-clamp mode and immuno
assays were used to monitor unitary exocytic fusion events and prolactin (PRL)
release, respectively. Intracellular cAMP concentration was raised with 3-
isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), forskolin and N6,2’-O-dibutyryl adenosine-
3′,5′-cyclic monophosphate (dbcAMP). HCN channel expression was
determined by using Western-blot, qRT-PCR and immunocytochemistry in
combination with confocal microscopy. Primary cell cultures were also
transfected with plasmid DNA encoding HCN2 together with enhanced-greenfluorescence
protein and a pharmacological agent was applied to evaluate
cAMP-HCN effects on exocytosis.
We observed that lactotrophs responded to forskolin and dbcAMP by releasing
PRL in a biphasic dose-dependent manner, since secretion increased and
decreased in the presence of low and high concentration ranges, respectively.
cAMP-increasing agents enhanced transient events, while full-fusion events
were prevented. Moreover, dbcAMP promoted the appearance of extreme
periodic bursts of transient events that exhibited longer fusion pore life-time and
wider diameters. The expression of the four HCN isoforms was confirmed at
mRNA transcript level in lactotrophs and, like in heart, kidney and pituitary, the
most abundant encodes HCN2 isoform. In HCN2 over-expressing lactotrophs,
dbcAMP not only enhanced the frequency of transient events and pore
conductance but also the frequency of full-fusion events. While, the HCN
channel blocker, ZD7288, reduced the frequency of full-fusion and transient
events elicited by dbcAMP and narrowed the fusion pore diameters. Finally, the
simultaneous reduction on PRL release, transient events frequency and fusion
pore diameters represented the main alterations observed after lactotrophs pretreatment
with micromolar aluminium concentration.
In conclusion, the results show that high cAMP reduces PRL secretion due to
the stabilization of the wide fusion pore state. Additionally, cAMP-HCN
signaling cascade affects exocytic activity and modifies fusion pore properties,
which also appear to be relevant in the aluminium induced cytotoxicity