Développement de méthodes de quantification en milieu complexe par chromatographie liquide microfluidique couplée à la spectrometrie de masse

Abstract

L’hepcidine est un biomarqueur peptidique dont l’intérêt tant comme outil de diagnostic que de suivi de pathologies est de plus en plus solidement établi. Il existe donc une demande forte d’outils sensibles et robustes afin de la doser au sein de milieux biologiques tels que le plasma ou le sérum. Une méthode analytique a été développée à l’aide d’un système chromatographique miniaturisé (nanoLC-chip) couplé à un spectromètre de masse permettant d’assurer un dosage de l’hepcidine à la fois sensible et fiable. Lors du développement de cette méthode, il a été constaté que la composition de l’échantillon avait une influence majeure sur la réponse analytique. Or, l’utilisation de systèmes chromatographiques miniaturisés implique souvent l’injection de volumes proportionnellement très importants par rapport aux dimensions du système, ce qui amplifie encore l’impact de sa composition. C’est pourquoi il est capital d’avoir une bonne compréhension des phénomènes qui ont lieu entre l’injection de l’échantillon dans le système chromatographique et la détection par spectrométrie de masse, et particulièrement lors du développement de méthodes analytiques quantitatives. Dans cette étude, nous avons utilisé la planification expérimentale afin de mieux comprendre le comportement chromatographique des peptides, ainsi que les facteurs qui influencent la sensibilité de la méthode développée. Un mélange de peptides a été sélectionné, varié tant du point de vue du poids moléculaire que du point isoélectrique et de l’hydropathie. Un plan de criblage a permis de délimiter le domaine expérimental ainsi que les facteurs significatifs parmi la composition de la phase mobile (proportion et nature de l’agent de paire d’ions) et de l’échantillon en lui-même (nature de l’agent de paire d’ions et proportion de solvant organique). Ensuite, un plan d’expériences factoriel complet a été mis en œuvre afin d’observer plus finement le rôle de chaque facteur ainsi que les interactions éventuelles qui les lient. Certains facteurs ont montré un effet très marqué tant sur l’intensité de la réponse que sur la rétention. Entre autres, la composition de l’échantillon, facteur parfois négligé lors du développement de méthodes, a démontré son importance capitale, en particulier sur les phénomènes de rétention des peptides. Les données obtenues ont également permis de dégager des conditions optimales d’analyse en termes de rétention et de sensibilité. Enfin, une analyse en composantes principales a également été réalisée sur le grand nombre de données récoltées dans le but de mettre en évidence d’éventuels propriétés physicochimiques des peptides qui pourraient avoir un impact significatif sur les réponses étudiées