Insights into the molecular machinery of piecemeal microautophagy of the nucleus in "Saccharomyces cerevisiae"

Abstract

Résumé : La microautophagie du noyau est un processus découvert chez la levure S. cerevisiae qui vise la dégradation de portions nucléaires dans la lumière vacuolaire. Ce processus appelé PMN (de l'anglais Piecemeal Microautophagy of the Nucleus) est induit dans des conditions de stress cellulaire comme la privation de nutriments, mais également par l'utilisation d'une drogue : la rapamycine. La PMN est due à l'interaction directe d'une protéine de la membrane externe de l'enveloppe nucléaire Nvj1p, et d'une protéine de la membrane vacuolaire Vac8p. L'interaction de ces deux protéines forme la jonction noyau-vacuole. Cette jonction guide la formation d'une invagination, qui englobe et étire vers la lumière vacuolaire une partie du noyau sous la forme d'un sac. Il s'en suit la libération d'une vésicule dégradée par les hydrolases. Les mécanismes moléculaires intervenant à différentes étapes de ce processus sont inconnus. Le but de ma thèse est de mettre en évidence de nouveaux acteurs qui interviennent dans la PMN. Dans la première partie de cette étude, nous présentons une procédure de sélection à la recherche de candidats jouant un rôle dans la PMN. Cette sélection a été effectuée dans la collection de mutants commercialisée chez Euroscarf. La procédure reposait sur l'observation que le nucléole (représenté par Nop1p) est le substrat préférentiel de la PMN dans des expériences de microscopie faites après induction de la PMN avec la rapamycine. Nous avons ainsi transformé la collection de mutants avec un plasmide portant le marqueur du nucléole Noplp. Par la suite, nous avons cherché par microscopie les mutants incapables de transférer Nop1p du noyau à la vacuole. Nous avons trouvé 318 gènes présentant un défaut de transfert de Nop1p par PMN. Ces gènes ont été classés par grandes familles fonctionnelles et aussi par leur degré de défaut de PMN. Egalement dans cette partie de l'étude, nous avons décrit des mutants impliqués dans le processus, à des étapes différentes. Dans la seconde partie de l'étude, nous avons regardé l'implication et le rôle de la V-ATPase, (une pompe à protons de la membrane vacuolaire}, sélectionnée parmi les candidats, dans le processus de PMN. Les inhibiteurs de ce complexe, comme la concanamycineA, bloquent l'activité PMN et semblent affecter le processus à deux étapes différentes. D'un autre côté, les jonctions «noyau-vacuole »forment une barrière de diffusion au niveau de la membrane vacuolaire, de laquelle Vphlp, une protéine de la V-ATPase, est exclue