Ikeda, Hiro

Tsuno, Sadako

池田, ひろ

津野, 貞子

Traditional Chinese

Kyoto Women's University Academic Repository (AIR) / 京都女子大学学術情報リポジトリ（京女AIR）

昭和60年11月(1985年) 一27-一研 究 報 告納豆製造過程における成分変化(第2報)水溶性 タンパ ク質 につい て一池 田 ひ ろ*,津 野 貞 子**The Componential Changes During the Manufacturing            Process of Natto (Part 2) —On the Water Soluble Proteins—Hiro Ikeda, Sadako Tsuno1緒 言 納豆は蒸煮大豆 に比べ消化性に優れ栄養価値の高い食品である。納豆に使用する大豆には中粒と小粒があり,一 般には小粒大豆を使用 した納豆が好まれているが,そ の理由は明 らかではない。 そこで,大 豆の形態の違いが発酵過程中の成分の変化や製品の出来上 り時聞などに影響を与えるのではないかと考え,粉 末大豆で納豆を製造 し,短 時間で栄養価値の高い食品として利用出来るかどうかを知るため前報1)に おいて旨味,香 り,栄 養的価値 に関連の深いア ミノ態窒素,ア ンモニァ態窒素,糖,ビ タ ミンBzの各成分について丸大豆使用納豆との比較検討を行 った。その結果,形 態の違いが納豆菌の繁殖に影響を与え,丸 大豆より表面積の大 きい粉末大豆 においては短時間で納豆化が行われるとい う結論を得た。 また,納 豆菌が生産する加水分解酵素のうち最 も納豆 の発酵過程に関与する酵素はタンパ ク質分解酵素であり,こ の酵素によ ってタ ンパ ク質はペプチ ドやアミノ酸にまで分解され2・9)納豆の旨味や消化性に影響を与えていると云われている。 そ こで今回はこのタンパク質分解酵素による発酵中の水溶性タ ンパ ク質の水解過程を,形 態の異なる丸大豆および粉末大豆使用納豆についてゲルロ過および電気泳動により比較検討を行ったのでその結果を報告する。II 実 験 方 法*京 都女子大学食物学科調理学第1研 究室**日 本生活医学研究所1.試 料の調製 納豆菌:宮 城野納豆製造所(仙 台市)で 純粋培養されたBacillus nattoを 使用 した。 原料:丸 大豆 はアメ リカ産の ものを使用 し,粉 末大豆はそれを 一196。Cで 瞬間凍結粉砕 したものを使用した。 納豆の製造:前 報D同 様に行 い発酵0か ら20時間まで2時 間ごとにとり出 し,こ れを試料とした。2実 験方法 各試料を乳鉢で充分す りつぶ したのち一定量を秤取し,約6倍 の4M尿 素を含む0.1MNaClに 懸濁 し1時 間室温で撹伴抽出を行い,8,000×gで20分 間遠心分離後その清澄液をとり,こ れをさらに56,000×9で1時 間遠心分離 し,こ の清澄液を水溶性タ ンパク質抽出液とした。 1)Sephadexに よるゲルロ過 Sephadex G-50を 水によ く分散 させ24時 間室温に懸濁放置して完全に膨潤させたのち4M尿 素を含む0.1MNaC1溶 液で3回 洗浄 したものを直径1.5cm,食物学会誌・第40号-28-1) Sephadex によるゲノレロ過Sephadex G-50による水溶性タンパク質のクロマトグラムを図1および図2に示した。吸光度280nmの測定では，生大立，蒸煮大豆については丸大豆，粉末大豆ともにKAV0， 0.8および1.0付近に3つのピークがみられ，発酵6時間では KAVOのピークが減少しKAV 0.6の位置に新しいピークが現われ， KAV 0.8のピークは増加する。発酵後10時聞になると丸大豆ではKAVOのピークはわずかとなり0.7付近に新しいピークが現われ， KAV 0.8および1.0のピークは増加する。発酵20時間では 280nmの吸収のほとんどがKAVO.9および1.0のピークの位置に観察される。Lowry法によるタンパク質の測定では，生大豆ではKAV O. 8および1.0の位置にはごくわずかしか検出されず，また蒸煮大豆においても KAV0.8および1.0の位置のタンパク質量は少ない。とのことより生大豆，蒸煮大豆における 0.8および1.0のピークは紫外部吸収をもっ低分子のペプチドやアミノ酸であると推察される。ゲJレロ過でみるかぎり丸大豆と粉末大豆の違いは明確でなく，両者ともに発酵時間の経過とともに高分子のタンパク質は納立菌により加水分解されKAVO.8付近のタンパク質量は増加する。発酵20時聞になると KAVO. 8のピークのタンパク質量は減少するが 280nmの吸収はほとんど変化しないととろから，さらに分解されて低分子のペプチドやアミノ酸にまで分解が進んだものと推察される。2) ディスク電気泳動8M尿素を含む159彰ポリアクリ jレアミドゲル電気泳動による結果を図3および図4に示した。図3にみられるように生大豆，蒸煮大豆，発酵2時間および4時間後の丸大豆および粉末大豆ともにゲノレの上部に 6本の鮮明なバンドを示し，その他数本の不鮮明なバンドがみられる。生大豆ではゲ、ノレの上端部および中央部に特に濃い鮮明なバンドが2本認められるが蒸煮大豆ではとのバンドは消失する。これは高分子のタンパク質が加熱iとより水解または変性凝固したためと考えられる。蒸煮大豆と発酵2時間および4時間後の試料では大きな変化は認められないが発酵6時聞になると急速に水解が進み泳動バンドは中央より先端部に移動し， 4"'-'5 本の成分が認められる。粉末大豆は発酵6時間後にかなり低分子化した泳動ノインドを与え，丸大豆よりも加水分解速度が速い乙とを示している。図4の発酵10"'-'20時間の各泳動図にみられるように発酵時間の経過とともにバンドの数は減少し，粉末大豆では14時間で先結果と考察III ? ? 、 ? ? ? ? ? 」 ?????、???、???Sephadex G-50による水溶性タンパク質のゲjレロ過18 ????12 o 24 生大立KAV 1.8 1.2 1.0 0.8 。????0.4 0.2 1.6 1.4 ? ? ? ? ? ? ? ? 「 〈? ? ? ?図1長さ 45cmのカラムに均一に流し込み， 4M尿素を含む 0.1M NaCl溶液で充分平衡化を行ったのち生大豆，蒸煮大豆，発酵6，10， 20時間の各抽出液についてゲルロ過を行った。まず，抽出液 0.2mlをカラムに吸着させ， 4M尿素を含む 0.1M NaClで溶出 (10mljhr)し，フラクションコレクターで1.5 mlずつ秤取して分画を行い，各画分の 280nm の吸光度を測定した。 あわせてLowry法lとよりタンパク質の定量を行い， 各ピーク曲線の総面積からこれらピークのタンパク質が全体に占める割合を算出した。らのトリスー2) ディスク電気泳動ポリアクリルアミドゲル電気泳動は Davis10)方法lとより 8M尿素を含む1596ゲ、jレを用い，グリシン緩衝液中で行った。3) 分子量の測定分子量の測定は Weber， Os born 10)らの SDSポリアクリルアミドゲ、ル電気泳動法に従い， 0.196 SDSを含む12.596ゲノレを用い O.lMリン酸塩緩衝液 (0.1形SDSを含む， pH 7.2)中で行った。SDS測定用には各抽出液の最終濃度が196SDS， 1 962-メjレカプトエタノー ノレ， O.OlMリン酸塩緩衝液(pH 7. 0)になるように調製したのち 600C30分間還元させたものを使用した。~ 29-昭和60年11月(1985年)1りふん I，i.h大 I，i.;W 2"1 12 ?????????????????21 12 。、副1.0 jo内f201lS:1I10.1 0.2 。jo内初1、'i:110.4 0.2 36 21 12 !1~主主、 K1J.21 12 21 1oI伴GI.'i:11?? ? ? ? ? ? ? ? ???24 12 。自民1.0 jo内ねり1，'i: 11 0.81-。0.5 KAV 0.5 KAV 3) 分子量の推定SDSポリアクリルアミドゲ、ル電気泳動による標準タンパク質の分子量と泳動速度の関係を図5に示した口この関係に基づいて泳動距離を分子量に変換し，発酵過程における分子量の経時的変化を示すデンシトメトリーによるパターン(図6および図7)を作成した。図6'とみられるように生大豆では分子量分布は100，000"'-'10，000の広範囲にわたっており，分子量100，000近くSephadex G-50による水溶性タンパク質のゲソレロ過る。端部に 1本の鮮明なバンドの他にいくつかの不鮮明なバンドがみられるが，発酵20時間では先端部の 1本のみとなる口丸大豆ではバンドの消失は徐々に進行し，発酵20時間で中央部と先端部に 2本のバンドがみられる。図2この結果より，プロテアーゼによって粉末大豆では約14時間でタンパク質の大部分が低分子のペプチドやアミノ酸にまで分解されるが，丸大豆が同程度まで分解されるためには発酵20時間が必要であると推察され? ??'1:大-U;I:<._r，. 大以1{i酔21寺11九大豆粉末大IA????? ???????? 1{i時Glh'fll1 図3 製造過程中の水溶性タンパク質の変化(8M尿素 1596ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動)食物学会誌・第40号泥酔81年IIJ昭和60年11月(1985年) - 31-九大豆粉末大tJ.発酔 ?C骨子 発酵 発酵 発両手 発酵101年!日l 121.'i=1I1 141キ|間 161年11 181キ11 201年11図4 製造過程中の水溶性タンパク質の変化(8M尿素 15%ポリアクリノレアミドゲルによる電気泳動)食物学会誌・第40号- 32 -+一一lホスホリラーゼP(MW:9A x 1(1) 4一-2アルブミン(MW:G.7 x 1(1) 骨一一・1オボアルブミン(MW >1.:3 x 1(1) 骨一一lカー ボニックアンヒド、ラー ゼ(MW::3.0XI01) ..---5トリプシンインヒビター(MW:2.01 X 1(1) 埠一一Gα ラクトアルブミン(MW: 1.44 X 1(1) 4.7 4.0 4.G 4.5 4.3 4.2 4.4 4.1 ????? ?，-'、，-'" 1.0 0.9 0.8 0.7 ????0.5 0.2 0.1 。村I~.J 移動liSDSポリアクリルアミドゲ、ル電気泳動による標準タンパク質の移動度ノfク質の熱変牲が著しいためと考えられる。しかし発酵6時間になると急速にプロテアーゼによる加水分解が進み，分子量40，000以上のものは減少し30，000._，15，000のものが増加する D 発酵 8._，12時間では徐々に加水分解が進み分子量30，000のポリペプチドは減少し20，000前後のものが増加する。発酵14時間になるとほとんどが20，000._，10，000の聞に分布し，丸大豆の20時間発酵のものとほぼ同程度の分布状態であった。その後も徐々に分解は進み，分子量20，000近くのポリペプチドはさらに減少し， 10，000に近いものが増加する。丸大豆，粉末大豆ともに発酵過程中にみられる分子量20，000._，10， 000のポリペプチドの増加は高分子のタンパク質の減少度より小さいが，これはこれらのタンパク質のほとんどがさらに低分子のペプチドやアミノ酸にまで分解されたためと考えられる。そこで SephadexG-10を用い 6M塩酸グアニジ図5に大きなピークがある。蒸煮大豆では加熱lとより水解されて分子量 100，000近くのタンパク質は減少し，60， 000._，40， 000のタンパク質が増加する。発酵2時間および4時間では蒸煮大豆に比べ著しい差はみられないが，発酵6時間になると分子量40，000以上のものは著しく減少して30，000._，18，000の範囲に多く分布し，発酵4時間まで存在していた分子量15，00"'_'10，000のものは減少している。これらのタンパク質は納豆菌のフ。ロテアーゼによって色素と結合できない程度に低分子化されたものと考えられる。その後発酵8._，20時間では時間経過に伴って徐々に分子量30，000前後のものが減少し， 20， 000._，10， 000のポリペプチドが増加する。図7に示すように粉末大豆は丸大豆とほぼ同様な傾向を示すが，蒸煮大豆の分子量100，000近くのタンパク質の減少は丸大立ほど顕著ではない。これは粉末大豆の方が表面積が大きいため加熱の影響が大きくタン- 33-昭和60年11月(1985年)発酵14時間生大医 発酵6時間発酵16時間発酵8時間来系:大'J.??????発酵18時間発酵10時間発酵 211，~:mj発酵20時!日j発酵12時間発酵41時間????????【????????????。?????? 。?????????????【??????。??【??? 。??????????????????????????? 。量図6 SDSポリアクリルアミドゲノレ電気泳動によるデンシトメトリー図〈丸大豆)波長:AEx 553 nm;スリット:o. 2X3mm;モード:透過リニアスキャンニング法;スキャンニング速度:50mm/min;チャート速度:50mm/min ? ?分食物学会誌・第40号- 34ー発酵14時nIJ発酵6時間生大豆発酵16時間発酵8時間蒸煮大豆?????発酵181王子!日j発酵10時間l発酵2時間発酵201時間発酵12時!日i発酵41寺陪j???????????????????。?????【 。???????????????????。???【???? 。???【??????????【??????。?????【 。【量図7 SDSポリアクリ Jレアミドゲノレ電気泳動によるデンシトメトリー図(粉末大立)波長:λEx553nm;スリット :0.2X3mm;モード:透過リニアスキャンニング法;スキャンニング速度:50mmjmin;チャート速度:50mmjmin ?分昭和60年11月(1985年) - 35ー4.0 3.8 3.6 1 :ミオグロビン(MW:17，201) [ 。切2 :ミオグロビン I十 I(MW:14，632) ~." :~ :ミオグロビン 1(MW:8，235) -、『.‘んごヘ、3.4 1 :ミオグロビンI(MW:6，383) 5:ミオグロビンI(MW:2 ，556) (i:ミオグロビン1-}11(MW: 1，695) 3.2 3.0 。 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 K<¥v 図8 Sephadex G-lO による 6M塩酸グアニジン存在下でのポリペプチドの標準曲線ンを溶媒とし，生大豆および丸大豆の蒸煮大豆，発酵6時間， 20時間の各抽出液を塩酸グアニジン 6Mおよび2-メJレカプトエタノール1労の濃度になるよう調製したのち 600C，30分間で還元させた溶液についてゲルロ過を行い，ポリペプチドの標準曲線により分子量の測定を行い，その結果を図8および図9に示した。図9にみられるように生大立では分子量 17，000(1)， 8， 100(2~ 5，300(3)の3つのピークが溶出されるが，蒸煮大豆では加熱によってピーク(1)のタンパク質およびピー ク(2)のペプチドが減少するがピーク(3)が増加し，新たに分子量4，200のピーク(4)が溶出される。発酵6時聞になるとプロテアーゼによってタンパク質やペプチドは水解されて，さらに(1)のピークは減少し代りに(2)および(3)のピークが増加し，分子量3，600のピーク(5)が新たに溶出される。発酵20時聞になると著しく水解が進み， (1) (2)のピークは減少し， (3)のピークは著しく減少， (5)のピークは著しく増加し，新たに分子量3，100(6)， 3，000 (7)， 2，300 (8)， 1，600 (9)のピークが溶出される。この結果lとみられるように発酵20時間になると大部分のタンパク質が分子量4，000以下のペプチドにまで分解されているととが裏付けられる。以上の結果より大豆中の水溶性タンパク質の発酵中のフ。ロテアーゼによる水解は発酵4時間以後急速に進み，納豆になると一部のタンパク質は残存するが大部分のものは分子量20，000-----10，000のポリペプチドおよび低分子のペプチドやアミノ酸にまで水解される。ま食物学会誌・第40号? 。?.) 'It併GIS:I日!と1:大 '.-i_0.5 ???Jと対~t併 2011 ，)":1 1\1方'~!!:k.ì}.? ??"，0>( へ0.5 1.0 図9 Sephadex G-10による 6M塩酸グアニジン存在下でのゲ、jレロ過分子量:1: 1. 7 X 104; 2: 8.1 X 103; 3: 5.3 X 103; 4: 4.2 X 103; 5: 3.6 X 103 ; 6: 3.1X103; 7: 3. OX103; 8: 2. 3X103; 9: 1. 6X103 0.6 0.4 0.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 方が各成分の変化が速く，今回の水溶性タンパク質の水解過程と一致した。さらに今後旨味と関係するアミノ酸組成の変化についての検討が必要である。納豆製造過程中の水溶性タンパク質の水解過程をゲJレロ過法，ポリアクリノレアミド電気泳動法を用いて明らかにし，また大豆の形態の違いがタンパク質の水解過程にどのような影響を与えるかを知るため丸大豆と粉末大豆を使用して検討を行った結果は次のとうりである。(1) Sephadex G-50 によるゲルロ過では発酵時間の経過とともにKAVOに溶出されたタンパク質の大部分約要IV た分子量推定やディスク電気泳動により丸大豆の発酵20時間のものと粉末大豆の発酵14時間のものの水解程度はほぼ同じであると考えられる。前報においてもほとんどの成分は発酵4時間までの変化は少く，またエネルギー源である糖を添加して納豆製造を行った場合にも粘質物の生成は発酵4時間までほとんどおこらないと乙ろから，納豆菌の発芽や増殖のためには温度400C，湿度80形で最低4時間が必要であると推察される。また前報でのアミノ態窒素，アンモニア態窒素，pH，ビタミン B2，糖の各成分の増減は丸大豆の発酵20時間と粉末大豆の発酵14時間の植がほぼ等しく，形態の違いにより丸大豆より表面積の大きい粉末大豆の昭和60年11月(1985年)は水解され， KAVO.8付近に溶出されたタンパク質が増加する。また一部のタンパク質は 280nmの紫外部吸収をもっ低分子のペプチドやアミノ酸にまで分解された。しかしゲルロ過では丸大豆と粉末大豆の違いを明らかにする乙とは出来なかった。(2) 蒸煮大豆，発酵2および4時間の水溶性タンパク質は分子量100，000'"'-'10，000の広い範囲に分布し，発酵6時間では40，000'"'-'10，000の範囲に分布する。発酵時間の経過とともに分子量40，000近くのものは減少し，20，000'"'-'10，000の範囲のポリペプチドが増加した。また丸大豆の発酵20時間と粉末大豆の発酵14時間のポリペプチドの分子量分布はほぼ同じであった。以上の結果より，大立の形態の違いが納豆菌の繁殖に影響を与え，表面積の大きい粉末大豆においてフ。ロテアーゼ、の活性も盛んとなってタンパク質の水解が速くすすみ，発酵14時間で納豆になることが明らかとなっfこ。終りに試料大豆を御提供いただいた大阪ガス株式会社に深く感謝致します。- 37ー参考文献1)池田ひろ，津野貞子:本誌， 39， 19， (1984) 2)渡辺篤二，中山修:農芸化学会誌， 36， 890， (1962) 3)越山育則，福島男児:栄養と食糧， 23， 297， (1971) 4)大塚一止，武恒子:新潟大学教育学部紀要， 18， 37， (1966) 5)斎尾恭子，若林昭，渡辺篤二:農芸化学会誌，42， 2， 90， (1968) 6)浅野三夫，宮本義広，大久保一良，紫崎一雄:日本食品工誌， 21， 262， (1974) 7)伊藤清技:栄養と食糧， 23， 196， (1971) 8)平宏和，姥名春枝，杉村敬一郎，桜井芳人:栄養と食糧， 1， 351， (1958) 9)平春枝，平宏和，桜井芳人:栄養と食糧， 17， 219， (1964) 10)電気泳動学会編:電気泳動実験法，文光堂(1978)

納豆製造過程における成分変化 (第2報) : 水溶性タンパク質について

http://repo.kyoto-wu.ac.jp/dspace/bitstream/11173/1303/1/0100_040_003.pdf

納豆製造過程における成分変化 (第2報) : 水溶性タンパク質について

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Kyoto Women's University Academic Repository (AIR) / 京都女子大学学術情報リポジトリ（京女AIR）