Nomoto, Mitsuko

Watanabe, Noriko

渡辺, 紀子

野本, 美子

English

Kyoto Women's University Academic Repository (AIR) / 京都女子大学学術情報リポジトリ（京女AIR）

昭和53年11月(1978年) 一19一食品材料 としての小麦胚芽に関す る研究Ⅱ  小麦胚芽 中 の トリプシ ン ・イン ヒビターの2,3の 性 質 につ い て渡辺 紀子 ・野本 美子Studies on Wheat Germ as a Food Material‡USome Properties of Trypsin Inhibitors in Wheat GermNoriko Watanabe and Mitsuko Nomoto1.緒 言 植物タンパク質には,あ る種の哺乳動物の消化酵素の働 きを阻害するものが何種類か知 られている。 この生化学的に活性なタンパク質 として最初に見い出された ものは大豆の トリプシン ・イ ンヒビターであ り1),この発見以来,多 くの研究者により,哺 乳動物のプロテアーゼ ・インヒビターが豆類をはじめ種々の植物組織 中から単離 されている2)。 すでに小麦胚芽中に も4種 類の トリプシン・インヒビターの存在が認め られ3),2種 類のインヒビターが単離 されている4)。 しか し最近,こ の小麦胚芽が食品材料 として利用 され るよ うにな り,こ れ らの利用 された食品中には,な お,ト リプシン・インヒビター活性が認め られていることが明らかにされた。 そこで本研究では,ま ず小麦胚芽中の トリプシン ・イ ンヒビターの分離 ・精製を行ない,得 られたこれ らのインヒビターが,体 内でプロテアーゼに対 して,どのような挙動を示すのかを,in vitroで 検討 した。また,植 物に存在す る代表的なプロテアーゼ ・インヒビターとして最 もよ く知 られてい る,大 豆の トリプシン・インヒビターと比較,検 討 した。II.実 験 方 法1.試 料 ヵナダ ・ウェスタン種の硬質小麦胚芽(1975年 産)を日清製粉 より入手 し,石 油工一テルで脱脂後,粉 砕*奈 良県栄養職員**本 学食品化学研究室して実験 に用 いた。2.小 麦胚芽 中の トリプシ ン ・イ ンヒビターの分離 ・ 精 製4) 脱脂 小麦胚芽200gに 精製 海砂200gを 加 えて,乳 鉢中で混 合磨砕 し,さ らに これ に少量の0.1M一 塩化 ナ トリウム水溶液 を加 え,ペ ース ト状に な るま で十 分に混和 し,時 々撹拝 しなが ら2時 間放置 し,そ の抽 出液 を60℃30分,熱 処理 した後,こ の ロ液 に硫安 を加 えて80%飽 和 させ る。 この混合液 を一夜放置 後,沈 殿 物 を集めて,水11に 溶解 し,遠 心分 離(1,000～1,200×g,15分)し て,水 に不溶 なグ ロブ リン系 の タ ンパ ク質 を除去す る。 この溶 液 をDEAF‐Sephadex A-25(pH.8.OM/20ト リス ・塩酸緩 衝液)カ ラム中に通 して脱色後,Bio-Gel P-30(pH 2.0～2.5,0.1M一 塩化 ナ トリウム/0.01M一 塩酸緩衝 液)及 び, CM-Sephadex C-25に 流 し,そ の活性画分 を 分画 し精 製 トリプシ ン ・イ ンヒ ビターA及 び,Bを 得 た。3. トリプシ ン と トリプシ ン ・イ ンヒビター との反 応4) トリフ シンと トリプシ ン ・イ ンヒ ビターを2:1の割 合でM/20ト リス 塩ー 酸 緩衝液(pH 8.0)溶 解 し,ピスキ ングチ ュー ブに入れ,図1に 示 す よ うに,あ らか じめ37℃ に しておい た緩衝液 中に入 れ,恒 温 機中で37℃ を保 ち,ス ターラーで緩衝 液 をた えず混 合 しながら反応 させた。反応 後,5℃ の状態 で水に対 して外 液がCl-freeに な るまで透析 を行 な った 。この時 トリプシ ンによ って加水 分解 され た ものは低 分子 ペ プチ ドにな り,膜 外 に出 るため膜 内には,イ ン ヒビター とFリプシ ンの複合体 のみが残 ることにな る。 この複合体 を5. 分離した卜リプシン・インヒビターの純度の確認ディスク電気泳動6)，Sephadex G-75カラムによるゲ、ルロ過を用いた。分子量の測定7% SDS電気泳動法7)及ぴ SephadexG-75カラムによるゲ、ルロ過めを用いて測定した。標準タンパクとして，チトクロム-c(分子量 13，000)，キモトリプシノーゲン (25，000)，卵白アルブミン (45，000)，牛血清アルブミン (67，000)を用いた。7. N-末端アミノ酸の決定わダンシルクロリド法を用いて，試料の N-末端アミノ酸を測定した。試料の N-末端アミノ酸を夕、、ンシル化し， K. R. Woods， K. T. Wangによるポリアミド薄層を用いて，アミノ酸の同定を行なった。標準ダンシル・アミノ酸として， L一α アラニン， Lー アスパラギン酸， Lー グルタミン酸， L スレオニン，グリシン，Lーノミリン， Lー プロリン， L-β フェニーノレアラニン，L シスチンを用いた。8. タンパク質構成アミノ酸の定量酸により加水分解を行ない， 目立自動アミノ酸分析機 (KLA-5B)でアミノ酸組成の定量を行なった。食物学会誌・第33号trypsin - 20ー6. inhibitor (pH8.0) active peptide buffer buffer trypsin 370C くご〉inactive peptide 仁コトリプシンとトリプシン・インヒピターとの反応方式pH 2.0ヤらいにすると，l乙分かれるので，この性質を利用して BioGe} P-30 で生成物を分画し，元のインヒピターと性質を比較しトリプシンとインヒピター図1結果および考察1. トリプシン・インヒビターのペプシンによる影響まず各インヒピターを，ペプシンと 10:1， 5: 1， 2: 1 の比率(モノレ)， pH 2.0， 37.Cで反応させ，その阻害活性の変化を調ぺた。その結果は図2に示すごとくでIII. Tこ。4. 阻害活性の測定トリフシン・インヒピターのトリプシンに対する阻害活性は 2-N -benzoy}-D， L-arginine-P-ni troanil-ide (BApNA) を基質とする BApNA法わを用いて測定した。C 100 B l ~，，~ h ←ー-→、、‘. 100 50 A ? ???????? 、 ? ??? ? ? ? 、 ?100 ????? ? ? ? ?50 C:大豆インヒビター30 time (H) 10 。time (H) ベフシンによるトリブシン・インヒピターの消化A:小麦匹芽インヒピタ -A B:小麦匹芽インヒビターB50 30 10 。50 30 time (H) 10 。図2- 21-3)。 また SDS電気泳動法により分子量を測定した結果，大豆インヒビターの分子量は 22，000，大豆ペプチドは 18，800であった。2-2 N末端アミノ酸の測定次にダンシルクロリド法を用いて，各インヒピターのN-末端アミノ酸を調ぺた。各インヒピターのN-末端アミノ酸をダン、ンル化し，それを加水分解したものと，標準アミノ酸とを薄層クロマトグラフィーにプロットして， 3種類の展開溶媒を用いて，一次元，二次元に展開した。その結果，インヒピタ -Aと， Aペプチドの N-末端アミノ酸はともに，スレオニンであっ???????。???• →・ asp. 図4 DNSー アミノ酸のクロマトグラムGl:小麦匪芽インヒピタ-AT-GI-P:小麦匪芽インヒピタ一生成物SI :大豆インヒピターT-SI-P:大豆インヒピタ一生成物ala. • gly. T-GI-P→'. thr. GI ;亨glu. _ pro. _ val. T-SI-P→・solvent-1 • phe. SI × 一→昭和53年11月 (1978年)ある。インヒピタ -Aとペプシンの場合，比率10:1では，反応時間3時間で10%，24時間で38%，50時間で54%の失活が認められた。 5:1では， 3時間， 24時間， 50時間と反応時間が長くなるにつれて， 48%， 72%， 92% と失活した。また 2:1では， 50%， 89%と失活し， 50 時間では完全に阻害活性が失なわれた。インヒビタ-Bにおいては， 10:1で5%， 14%， 17%， 5: 1で6%， 20%， 22%と失活し， 2:1では， 25%， 64%， 80 %と失活した。 これに対して，大豆インヒピターでは， 10:1では， 3時間で39%，24時間で92%，34時間で完全に失活した。 5:1では， 3時間で61%，24時間で完全に失活し， 2:1では， 3時間で75%，20時間で失活した。 このように， インヒピタ-A， B は，大豆インヒビターに比べて，ペプシンに対して安定であることがわかった。これらのことより，晴乳動物の胃の中でインヒビターが完全に失活することは不可能であることが予測される。そのために次に，インヒピターのトリプシンとの相互作用について検討してみた。2. トリプシン・インヒビターおよびトリプシンとの反応生成物について2-1 トリプシンおよび生成物の分子量小麦/lli芽中のトリプシン・インヒビターおよび大豆インヒピターの生成物は，それぞれトリプシンに対して，強い阻害活性を示した。これらインヒピターおよび生成ペプチドの分子量を SephadexG-75カラムによるゲルロ過と SDS電気泳動法を用いて測定した。ゲ、ルロ過により分子量を測定した結果，インヒピタAーペプチドは 6，000であった(図-A は 17，000，た。次に大豆インヒピターのN-末端は，アスパラギン酸で概知の事実と一致した。また大豆ペプチド、は，ク、、ルタミン酸であった(図4)。2-3アミノ酸組成の測定次に各インヒピターのタンパク質構成アミノ酸を表1に示した。小麦のタンパク質として代表されるグルテニンの主な構成アミノ酸は， ク、、ルタミン酸32.8%， プロリン13.4%，グリシン9.2%でこれら 3種類で50%以上をしめ，その他のアミノ酸は， 1.5%'"'"'3.1%である。それに比べてインヒピターのアミノ酸組成は，主要アミノ酸として，ク、、ルタミン酸であるが，ク。ルテニンに比較して塩基性アミノ酸のリジン，アルギニン，酸性アミノ酸のアスパラギン酸が多く，また，プロリンが少glucagon ゲソレロ過による小麦匹芽インヒビタ-Aおよび生成ペプチド、の分子量A:小麦匹芽インヒビタ-A， 90 p:生成ペプチドP→ 70 50 tube no. M.W 104 10" O 同3- 22ー表1 インヒピターおよび反応生成物のアミノ酸組成アミノ酸 GI-A T-GI-P SI T-SI-P Lys. 6.2 2.1 (i .1 5.9 His. 1.8 1.5 1.3 1.2 Arg. 8.0 2.7 5.5 4.7 Asp. 7.8 10.8 16.5 15.2 Thr. 5.9 2.9 4.1 4.1 Ser. 7.2 9.7 7.3 8.7 Glu. 17.6 26.7 12.0 11.5 Pro. 2.0 1.7 3.3 3.0 Gly. 15.8 17.0 6.7 9.9 Ala. 11.3 2.5 4.8 5.3 Cys. 1.3 1.8 1.9 2.2 Val. 3.7 2.9 6.2 6.2 Met. 1.6 4.2 1.5 0.9 Ileu. 2.1 2.9 7.0 6.9 Leu. 4.2 3.0 8.0 7.8 Tyr. 1.9 6.0 2.6 2.3 Phe. 1.6 1.6 5.2 4.2 (mole %) GI:小麦匪芽インヒピタ-A， T-GI-P:小麦匹芽インヒビタ一生成物SI:大豆インヒビター， T-SI-P:大豆インヒピタ一生成物なカ〉った。IV.総括トリプシン・インヒピターが体内に摂取された場合，ペプシンとの反応において，完全に失活きれず，食物学会誌・第33号トリプシンを阻害すると予測される。またインヒビターはトリプシンを阻害するだけでなく， トリプシンと反応して，低分子化されたペプチドを生成し，しかもこのペプチドもトリプシンに対して阻害活性を示すことが認められた。このような事実は，食品中のタンパク質の栄養学的な評価において一つの問題を提起するものであると考える。最後に，本実験にあたり御指導下さいました本学の光永俊郎助教授に深く感謝致します。参考文献1) Kunitz， M.， J.Gen. Physiol.， 29， 149 (1946) 2) Pressey， R.， J.Food Sci.， 37， 521 (1972) Belew， M.， Porath， J.and Sundberg， L.， Eur. J. Biochem.， 60， 247 (1975) Boisen， S.， Phytochemistry， 15，641 (1976) 3) Mitsunaga， T.， J.Nut1'. Sci， Vitaminol.， 20， 153 (1974) 4) Mitsunaga， T.， in press. 5) Erlanger， B. F.， Kokwshy， N. and Cohen， W.， Arch. Biochem. Biophys.， 95， 271 (1961) 6) Ornstein， L. and Daivs， B.， Ann. New York Acad. Sci.， 321， 404 (1964). 7) Shapiro， A. L.， Vinnela， E. and Majiel， J.V. Jr.， Biochem. Biophys. Res. Comm1仰.， 28， 815 (1967). 8) Andrews， P.， Biochem. J.， 96 595 (1965). 9)成田耕造，村地孝編“生化学実験講座 1，タンパク質の化学1"東京化学同人， p. 142 (1976) 

食品材料としての小麦胚芽に関する研究 : II 小麦胚芽中のトリプシン・インヒビターの2,3の性質について

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