Miyazaki, Yukiko

Ohta, Kaoru

Sakata, Yukiko

坂田, 由紀子

太田, 馨

宮崎, 由紀子

English

Kyoto Women's University Academic Repository (AIR) / 京都女子大学学術情報リポジトリ（京女AIR）

一,22一 食物学会誌 ・第18号魚類の腐敗検定法に関す る研究(3)ヌ ク レオチ ドの変化 に よ る検 定 につ い て宮 崎 由 紀 子太 田  馨坂 田 由 紀 子   Studies on the Determinate method for the Grade    of Putrefaction of Fish. Part 3. On the Determination by the Decomposition of Nucleotide.Yukiko Miyazaki,Kaoru OhtaYukiko Sakata,1.ま え が き 著者等は魚類の腐敗度を検定す るに当 り,従 来か ら行なわれていない新 しい方法,あ るいは.よ り正確な方法を見出そ うと種 々検討を行なっている。 魚類の腐敗度を判定するには種 々の方法があるが.魚肉の腐敗に よる分解生成物を測定する方法,例 えば     ①      ②            ③      ④ア ンモ ニア,ア ミノ酸,ト リメチル ア ミン.硫 化水 素    0イン ド0ル 等を定量する方法が よく行なわれるが,これ らの結果 より腐敗初期を判定することは.研 究者により,ま た魚種等により多少異っている。 魚類の腐敗は細菌に よる分解作用の外,同 時に,あるいは細菌の作用に先立 って酵素作用による自己消化がおこり,自 己消化のため種 々の変化が進行する。 これ らの変化 のうちにはヌクレオチ ドの著 しい変化 も見     ⑥られる。斉藤 らはヌクレオチ ドの分解に より生ずるヒポキサンチンを定量 し,鮮 度検定の指標として適 していると報告 している。著者等は ヌクレオチ ドの変化によ り,魚 肉中に残存する成分,あ るいは分解に より生ずる成分を定量 し,腐 敗度検定を行なうことが可能であるかどうかについて実験を試みた。その結果,魚 肉中に残存するヌ クレオチ ドのDNA, RNA量,お よび分解に より生成するGuanine量 を定量することに より,腐 敗度を判定 しうる可能性のあることを認めたので報告する。 1.実 験 の 部亜.1.供 試材料 海産魚類を死直後の最 も新鮮な状態で入手することは困難であるため,供 試魚類 として,フ ナをえら ん締曇本学教授  締本学助手  箭昭和40年度卒業生だ。体長約15cm,体 重約1209の フナの頭部を強打 して死亡させ しめ,そ の まま300Cの 恒温器中に保存 して鮮度を低下せ しめ,一 定時間後に取 り出して背肉の白身の部分をそれぞれの実験に供 した。皿.皿. 実験方法 皿.H.1.揮 発性塩基態窒素の定量魚類の腐敗度を検定するため従来か ら行なわれている方法のうち,揮発性塩基態窒素を定量する法を本実験の比較対照 と し       0てえ らび,常 法に よ りこれ を行 なった。 皿.E.皿.核 酸 の抽出,分 画核 酸 の抽 出,分 画 には種 々の方法 があ るが著 者等 Schmidt, Tannhauser,     ⑧Schneider法(S. T. S法 〉に よ り行 なった。 酸可溶 性燐物 質の除 去 供 試 フナ肉59を と り,水15m1を 加 え, Potter-Elvehjemホ モ ゲナイザ ーに て氷 冷 しなが らホ モ ジネー トを作 り,こ のホモ ジネ ー ト5m1に 冷10°oト リクロール酢酸(TCA)12.5mlを 混合 して よ くか き まぜ遠 心す る。沈 澱は も う一度12.5m1の 冷10°oTCAに 懸濁 して遠心 し,こ のTCA抽 出液 と洗液 とを合せ て酸可溶 性燐 物質分画 と し,沈 澱 は 次の操作 を行 な う。 燐脂 質の除去 前項 の10%TCAで お と した沈 澱 を5mlの 水に 懸濁し,冷95°oエ タノ ール20m1を 加 え て よ くまぜ て遠 心す る。沈澱 は も う一 度5m1の エ タノールで洗 い,沈 澱をエ タ ノール:ク ロロホル ム=3:1の 混液25m1で2回,エ タノール:エ ーテル=3:1の 混 液25m1で1回それ ぞれ室 温で しば ら くか き まぜた 後遠心 す る。 最 後に エ ーテル で洗い,沈 澱 を室温 で乾燥 す る。 これ らの抽 出液,洗 液を合せ て燐 脂 質分画 と し.沈 澱 につ き次の操作を行 な う。昭和41年7月(1966年) RNA分 画 前項で得た沈澱に0.3N水 酸化カ リウム液50m1を 加え,37。Cで20時 間水解す る。水解後濃過塩素酸で中和 し,更 に濃過塩素酸を加えて過塩素酸について5%とすると,蛋 白質,DNA, 過塩素酸カ リウムの沈澱が得 られ る。遠心 して沈澱は251nlの 冷5%過 塩素酸で2回 洗 う。 この過塩素酸抽出液と洗液 とを合せ65m1と しRNA分 画 とす る。 DNA分 画 前項で得た沈澱を5°o過 塩素酸5m1に 懸濁させ,90。Cで15分 間加熱 し冷却後遠心す る。 沈澱は もう一度5%過 塩素酸12.5m1で 洗い,抽 出液と洗液とを合せてDNA分 画とする。 皿.皿.皿 。RNA, DNAの 定量法                00 RNAの 定量はオルシノール反応法を用いた。 鉄アンモニウム硫酸1.359と オルシン2.09を50mlの 蒸留水に とか し,冷 所に保存する。使用 直前に保存液2.5m1を 濃塩酸41.5m1に とか し,水 で50m1に うすめる。本液3m1をRNA検 液1m1に 加え,沸 騰水浴中で20分間加熱する。冷後エル マ分光光度計で665mμ の吸光度を測定 し,対 照 として溶媒を同様に処理 した ものを用い,純RNAか らの標準曲線 よりRNA量 を求めた。              ⑫ DNAの 定量はイン ドール反応法を用いた。 DNA検液1m1に,0.04°oイ ン ドール溶液1mlと 濃塩酸1m1をを加えてよくまぜ る。沸騰水溶中で10分 間加熱後流水中で冷却 し.ク ロロホル ム4mlを 加え1分 間 よく振りまぜ.軽 く遠心 して2層 に分け,ク ロロホル ム層を駒込 ピペ ヅトで除 く。この操作を3回 くり返 し,桃 色に着色す る不純物を完全に抽出除去する。得た検液をエルマ分光光度計にて490mμ の吸光度を測定す る対照 として試料溶液の溶媒を同様に処理 した も の を用う。純DNAか らの標準曲線よりDNA量 を求めた。            (12) H.∬.IV.有 機 塩基 の分離 有機塩 基 の分離 をペ ーパ ー クロマ トグラフ ィーに より行 な った 。供試 フナ肉59を と り,水15m1を 加 えてホモ ジネ ー トを作 り,10°oTCA25m1を 混 じて よ くまぜ た 後遠心 し,沈 澱 を も う一 度10°oTCA 25m1で 洗い,抽 出液 と洗 液 とを合 せ, これを2mlに 濃 縮する。 そ の0.02m1を 検液 と した。 東 洋 炉紙N(L50,展 開液 メタノール:濃 塩 酸:水(70:20:10)を 用 い.一 次元 上昇法 に よった。展 開 後炉 紙を 風乾 し,紫 外線照射 に よ りスポ ットを検 出 した。有機塩 基 の うちAdenie, Guanine, Uracil, Cytocineにつ き同時 対照試 験を行 な った 。 スポ ッ トの部分 を細 く刻み,共 栓付試験管 に入れ,一23一0.1N塩 酸5鵯 三を加えて37QCで 軽 く振 り抽出する。抽出液を炉過 し,炉 液の紫外部吸収曲線を島津自記光電分光計に よ り測定 し,検 液の塩基の種類を決めた。             ⑬ 皿.皿.V 有機塩基 の定量 前項 と同様に してスポ ヅトか らの抽 出を行ない,248mμ の吸光度を測定 した。 ブラン クと して検液 の代 りに検液の溶媒のみをつ けて展開 し,ス ポ ットに相当す る位置を切 りと り,同 様に処理 したものについて測定 した。 皿.皿. 実験結果 皿.皿.1.揮 発性塩基態窒素を定量 した結果をフナ肉1009中 のmg数 で示 し,こ れを図示すると図1の ごと くである。図1.鮮 度低下 と揮発性塩基態窒素   (30。C保 存,フ ナ肉100g中) 皿.ID.H オルシノール反応法によるRNA標 準曲線およびRNAを 定量 した結果を フナ肉1009中 の量で示すと図2お よび図3の 通 りである。 皿.皿.皿 イ ン ドール反応法に よるDNA標 準曲線およびDNA定 量結果を図示すれば図5お よび図4の ごとくである。一24一 食物学会誌 ・第18号図2.RNA標 準 曲線(オ ル シノール反応 法 〉 図4.DNA標 準曲線(イ ン ドール反応法〉図3.鮮 度低下 とRNA量 (30。C保 存.フ ナ 肉1009中)図5.鮮 度低 下 とDNA量(30。C保 存,フ ナ肉1009中)昭和41年7月(1966年) 一25-一 H.皿.IV ペ ーパ0ク ロマ トグラフィ ーに よ り分離した塩 基 の紫外 部 吸収曲線 は図6の よ うであ り,検 出された 塩基 はGuanineと 一致 する。 Guanineの 標準曲線 は図7の ごと くであ り,Guanineを 定量 した 結果は図8の 通 りで あ る。図8 鮮度 低下 とGuanine量(300C保 存,   フナ肉100g中)図6 有機塩基の紫外部吸収曲線      皿.考    察一般に魚類の鮮度と揮発性塩基態窒素との間には表1の ような関係がある。表1.魚 肉の鮮度 と揮発性塩基態窒素魚肉の鮮度 魚肉 11!中 の揮発性塩基態窒素極めてi新鮮な魚肉普通のi新鮮な魚肉腐敗初期の魚肉腐敗した魚肉5～10mg15^-25mg30^-40mg50mg以 上図7.Guanine標 準 曲線 表1に よ り,腐 敗初期 の魚肉1009中 には30～40mgの揮発性塩基態窒素を含むが,本 実験条件において,図1か ら30～40mgの 揮発性塩基態窒素の生成する時期は約28～31時 間後であ り,28～31時 間をもって本実験における腐敗初期の時期 とした。 図3に より,フ ナ肉中のRNA量 は鮮度の低下と共に次第に減少 し,本 実験におけ る腐敗初期である28～31時 間後には,RNA量 はフナ肉1!!中493mg～486mgと な り,本 量をもって腐敗初期 と判定す る一指標とすることができる。 図5に より,フ ナ肉中のDNA量 も鮮度の低下 と共に次第に減少し,28～31時 間後には.フ ナ肉1009中にDNA量179.8～177.6mgに 達 し,こ の量を もって腐敗初期 と見なすことがで きる。一一一26一 食物学会誌 ・第18号 フナ肉の トリクロール酢酸抽出液中に,有 機塩基 としてポ リン塩基の うちGuanineを 検出 し,そ の量は図8の ごとく.鮮 度が低下するに したがい増加する。本実験における腐敗初期である28～31時 間後には,フ ナ肉100gか ら13.0～13.5mgに 達 し,本 量をもって腐敗初期判定の一指標 とすることができる。 本結果はいずれ も数回測定 した平均値であるが,他の魚種 については 目下検討中であるo 以上要するに魚 肉中の核酸構成分のRNA, DNA量および核酸構成成分の分解により遊離するGuanine量を定量 して,魚 肉の鮮度を判定することが可能であると思われる。      w.要    約 ヌクレオチ ドの変化に より,フ ナ肉の腐敗度を判定す る寧験を行なった結果,肉 中に残存するヌクレオチドを構成するRNA, DNA量 お よび遊離 し抽出され るGuanine量 を測定す ることにより,腐 敗度を知ることが可能であると思われる。 以上 の結果を表一にすれば表2の ごとくである。表2 フナ肉の鮮度とヌクレオチ ド成分腐 敗 初 期 に お け る 量   ㎎/100930 ^-40493 ^-486179.8^177.613.0^  13.7文成 分揮発性塩基態窒素RNADNAGuanine献1)野 中 順 三 九,他:水 産 食 品 学,75(昭40)2)Lucke U. Gedel Z. Unters. Lebens.,  70,441 (1935)3)B.T. Cromwell:Biochem.7.,46, 578  (1950)4>足 立 晃 太 郎,田 中 千 代 子:本 誌, 5,38(1958)5)Official methods of analysis of A. O. A.  C.7th. Ed.302(1950)6)Saito, T. et a1:日 水 誌,24,749(1959)7)京 大 農 化:農 芸 化 学 実 験 書,3,1117(昭32)g)Schneider, W. C.;T. Bio1. Chem.,164,  747 (1946}g)Brown, A. H.:Arch, Biochem.,11,269  (1946}10)Mejba士n, W.;Z. Physiol, Chemy,258,117  (1939)li)Ceriotti, G. J. Biol. Chem.,19＄,297(1952)   214, 59 (1955)12)日 本 化 学 会:実 験 化 学 講 座,23,306(昭32)

魚類の腐敗検定法に関する研究 (3) : ヌクレオチドの変化による検定について

http://repo.kyoto-wu.ac.jp/dspace/bitstream/11173/1169/1/0100_018_005.pdf

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