Katagiri, Chisato

Shimizu, Mayumi

清水, まゆみ

片桐, 千里

English

Kyoto Women's University Academic Repository (AIR) / 京都女子大学学術情報リポジトリ（京女AIR）

一22一 昭和58年12月(1983年)黒 大 豆(Glycine max MERRILL forma Kuromame MAKINO)   の ト リプ シ ン イ ン ヒ ビ タ ー に つ い て(第2報)一一一ト リ プ シ ン イ ン ヒ ビ タ ー の 性 質 一清 水 まゆみ,片 桐 千 里Trypsin Inhibitors of Kurodaizu (Glycine max MERRILL forma             Kuromame MAKINO) (Part 2)  —Characterization of Trypsin Inhibitors—Mayumi Shimizu and Chisato Katagiri 前報ヱ)において,黒 大豆より11種 の トリプシンインヒビターを分離 したが,さ らにこれ らの諸性質について検討 し,若 干の知見を得たので報告する。1.実 験1.実 験材料 黒大豆は兵庫県産丹波黒を用いた。 トリプシン(牛 膵臓,2回 結晶),α 一キ モ トリプ シ ン(牛膵臓,3回 結晶),ペ プ シ ン(豚 胃,2回 結晶)はSigma社 製品を,プ ロナーゼは科研化学,ナ ガーゼは長瀬産業の製品を使用 した。 また,α 一N一ベ ンゾイル ーDL一アル ギ ニ ンーP一ニ トロアニ リド塩酸塩(BANA)は 財団法人蛋白質研究奨励会 よ り,カ ゼインはMerck社,ヘ モグロビンはDifco社 より入手した。 分 子量 測 定 用 標 準 タ ンパク質はSchwarz/Mann社 の製品を使用 した。その他の試薬は市販特級品を用いた。2. トリプシンインヒビターの調製 前報により単離した トリプシンインヒビターを用いた。各調製物は凍結乾燥 した後,実 験まで冷蔵保存 した。3.分 子量の測定 Shapiroら2)の 方法によるSDS一ポリアク リル ア ミドゲル電気泳動法を用いた。1%SDSを 含む7%ゲ ルを用い,0.1Mリ ン酸緩衝液(1%SDS含 有, pH 7.1)中 で行 った。4.等 電点の測定 LKB社 製薄層ゲル等電点分離装置を使用 し,ア ンホラインにより pH3.5～9.5の 勾配を有するポ リアク リルア ミドゲルを用いて測定 した。京都女子大学食物学科食品学第4研 究室(食 品化学)5. ア ミノ酸の 分析 試料を6M塩 酸 中,110℃ で24時 間加水分 解後,835型 日立高速 ア ミノ酸分析計で分 析 した。6.プ ロテ アーゼ活性 および イ ンヒビター活 性の測定 1) トリプ シン活性 の測定 カゼ イ ンを基質 とす る萩 原 らのカゼ イ ン消化法3)の 改良 法4), ま たは合 成基質BANAを 用 いるErlangerら の方法5)の 改良 法4)を用 いた。 2)α 一キモ トリプ シ ン活 性 の 測定 カゼ イ ンを基質 とす る萩原 らの カゼ イ ン消化 法3)の 改良 法を用い た。す なわ ち,0.2m1のmキ モ トリプ シン溶液(25 mg%)と0.5mlの0.01 Mリ ン酸緩衝 液(5 mM CaC12含有,pH 8.0)を 混合 し,37℃ で2分 間放置後,1%カ ゼ イ ン溶液(pH8.0)3m1を 加 えて37℃ で10分聞 反応 させ た。 次 に3mlの 反応停止 液(0.13 Mトリクロル酢 酸,0.26M酢 酸 ナ トリウム,0.39 M酢酸 よ りな る混合液)を 加え,10分 間放 置 した。 これを ろ過 し,ろ 液1m1を と り,0.55 M炭 酸 ナ トリウム5mlと 市販 フェノール試 薬5倍 希釈 液1mlを 加え,37℃ で20分 間放 置 した 。この液の660nmに おける吸光度 を測定 し,α 一キ モ トリプシ ン活性 と した。この際 に1%カ ゼ イ ン溶液 と反応停止 液の添加を逆 にした もの をブ ラ ンク と した。 3)ペ プ シ ン活性 の測定 ヘモグ ロビ ンを基質 とするAnsonの 方法6>を 改良 して用 いた。0.2mlの ペ プシン溶液(25mgoo)と0.5mlの 水 を混合 し,37。Cで2分 間 放置後,1.2°0ヘ モ グ ロ ビ ン溶液(0.13M食物学会誌・第38号NaCI含有， pHl. 8) 3 mlを加えて 370Cで10分間反応させた。次に 3mlの反応停止液 (0.44M トリクロル酢酸)を加え， 10分間放置した。乙れをろ過し，ろ液 1mlをとり， 0.55 M 炭酸ナトリウム 5mlと市販フェノーノレ試薬5倍希釈液 1mlを加え， 370Cで20分間放置した。この液の 660nmにおける吸光度を測定し，ペプシン活性とした。1.2箔ヘモグロビン溶液と反応停止液の添加を逆にしたものをブランクとした。4) プロナーゼ活性の測定 プロナーゼ溶液 (100mg箔)を用い， BANAを基質とするトリプシン活性の測定法と同じ方法で測定した。5) ナガーゼ活性の測定 ナガーゼ溶液 (60mg%)を用い， αー キモトリプシン活性の測定法と同じ方法で測定した。6) インヒビター活性の測定各酵素液とインヒビター液を反応させた後，同様の操作を行い，吸光度(T*)を求めた。 これとインヒビターを含まないコントロー ノレ (T)から次式により阻害度 (1)を算出した。1(労)= 100(T -T*)jT I. 結果および考察1. 分子量の推定 黒大豆より単離した11種のトリプシンインヒピターについて， SDSー ポリアクリノレアミドゲ、jレ電気泳動により分子量を推定した結果を Fig.110.0 寸0 ・ζ5.0? ??〉〉0 3 さ1.0~ 0.5 。 0.4 - 23-に示す。標準タンパク質として， インシュリン (M.W.6，000)，チトクロムC(M.W.12，400)，ミオク。ロビン(M入!V.17，800)， キモトリプシノーゲン A(M入爪25，000)，オボアノレプミン (M入TV.45，000)を用いた。 11種中，最も分子量が小きかったのは6bの7，200であり，最も大きかったのは7で21，000と推定された。本研究では非透析性のトリプシンインヒビターを対象として単離を行ったが，透析性と考えられる 6bが単離された乙とは，前報1)での分離精製条件にさらに検討が必要であるととを示している。2. 等電点の測定 各インヒビターの p1を測定した結果， 5bがおよそ 4.5と最も低く，次いで 6a，6b， 7 が4.8，-，4.9という値を示した。最も高いのは 1bでおよそ6.8であり，その他のインヒピタ-la，2， 3a， 3b， 4 および 5aの等電点はそれぞれ， 6. 7， 6.2， 5.8， 5.7， 5.8および5.5であった。3. アミノ酸組成 11種のインヒピターはすべてアスパラギン酸，セリン，グノレタミン酸を多く含んでいた。4. トリプシンに対する阻害活性の強さ BANAを基質とする方法で測定した。それぞれの試料について，縦軸にトリプシン残存活性を，横軸にインヒピター/トリプシンの重量比をとり， トリプシン残存活性曲線を描いた。この曲線のトリプシン残存活性50箔の点より接線をのばし，横軸との交点をトリプシン活性を100%阻害する重量比とした。この結果と先に推定し0.6 0.8 1.0 ハヘobilityFi忌.1. SDSー ポリアクリルアミドゲノレ電気泳動による分子量の推定- 24ー100 ??h -〉ミ500 c c o E ω a: 。 1.0 100 50 。 1.0 昭和58年12月 (1983年〉100 50 。 1.0 Inhibitor内 /Trypsinpg Fi邑.2. トリプシンに対する阻害活性の強さた各インヒビターの分子量とを考え合わせると， トリプシン1モルに対し， 5bと6aは0.5モノレが反応し，その他は1モノレが反応する乙とがわかった。各インヒビターともトリプシンと化学量論的に反応し，特に5bと 6aはトリプシンに対する反応中心が1分子当り2個存在していると推察された。 1，6a， 7についてのトリプシン残存活性曲線を Fig. 2 I乙示す。5. トリプシンインヒビター活性の熱による影響 各インヒピターを 0.01M リン酸緩衝液 (pH7.5)に溶解し， 60， 80， 980C の各温度で一定時間熱処理した後，カゼインを基質とする方法でトリプシンに対する100 6Q，80。? ?1a 〉、〉-.: ~ 50 0 C C o s GI: 。 30 100 インヒピター活性の強さを測定した。各測定値は未処理のインヒピター活性を100必とした残存活性に換算した。その結果， 600Cでは60分間熱処理しても全インヒビターともまったく失活しなかった。 800Cでは60分間の加熱で 6a，6b， 7が6，，-，7%失活する程度で，他のインヒピターは変化を示さなかった。 980Cでは 2はまったく安定であり，他のインヒビターも30分で5，，-，10%，60分で10，，-，15%の活性を損失するのみであった。全インヒピターは極めて熱に安定である乙とが明らかになった。 1a，2， 7についての結果をFig. 3に示す。60，89，980 50 2 60 0 30 100 7 50 60 0 60 30 Time (min) Fig.3. トリプシンインヒピター活性の熱による影響食物学会誌・第38号 - 25ー100 2 5 ¥〆次'ー、ノ、.星Z5ZF 50ト50十、 50 aP E z 。 2 3 0 2 3 0 2 3 Inhibitorμg/Pronαseμg Fi昌.4. プロナーゼに対するインヒピター活性6. 他のプロテアーゼに対するインヒビター活性αー キモトリプシンに対するインヒビター活性5， 6a， 6b， 7が αー キモトリプシンに対しインヒビター活性を示したが，化学量論的には反応しなかった。そTable 1. 画分7とSTIの比較Fraction STI 7 Molecular weitht 21，000 20，100 Isoelectric point 4.8，-，4.9 3.5，-，4.4 Amino acid composition (N o. of residues p巴rmolecule) Aspartic acid 28 26 Threonine 9 7 Serine 15 11 Glutamic acid 21 18 Glycine 16 16 Alanine 11 8 Half-cystine 6 4 Valine 11 14 Methionine 1 2 Isoleucine 10 14 Leucine 10 15 Tyrosine 3 4 Phenylalanine 9 9 Lysine 10 10 Histidine 10 2 Arginine 9 9 Proline 10 10 Tryptophan 1 2 の他のインヒビターはまったく活性を示さなかった。2) ペプシンに対するインヒビター活性全トリプシンインヒビターとも活性を示さなかった。3) プロナーゼに対するインヒビター活性全トリプシンインヒピターがプロナーゼに対して強く阻害した。重量比でプロナーゼ 1に対し， 0.5"-，， 1の比で阻害し，ほぼ化学量論的に反応するととを示した。Fig.4は 2，5， 6b についての阻害曲線である。プロナーゼ、1に対し， 2は1.7， 5はほぼ 1，6bはO.7の重量比で阻害した。4) ナガーゼに対するインヒビター活性 すべて阻害活性をもたなかった。以上，黒大豆より単離した11種のトリプシンインヒどターの諸性質について調べた。大豆のトリプシンインヒピターのうち，もっともよく研究され，知られているのは Kunitzインヒビター (STI)と Bowman-Birkインヒビター(BBI)だが，画分7は， STIの分子量が20，100わであるとととアミノ酸組成8)から比較してみるとほぼ一致しており， Kunitz型インヒピターであろうと推察された。 しかし，等電点9)がやや異なり， ヒスチジン含量に差があるため，さらに検討が必要である (Table1)。 また， 画分 6bの分子量はBBI に近い値10)であるが，アミノ酸紐成において半シスチン，セリン，プロリンの残基数1 >が異なっており，別のインヒビターであると考えられる。11種のトリプシンインヒビターは熱に対して非常に安定であり，プロナーゼ、に対しでも阻害活性を示した。これらのことは黒大立を食品として調理加工した場合，- 26-どのような挙動を示すのか非常に興味深いことである。本研究を行うにあたり，御指導下さいました本学光永俊郎教授に深く感謝いたします。参考文献1)片桐千里，清水まゆみ:京都女子大学食物学会誌，38， 17 (1983). 2) A.L. Shapiro and J.Y. Maziel: Bz.ochem. Bi白.0thys. Res. Commun.， 28， 815 (1967). 3) B. Hagihara， H. Matsubara， M. N akai and K. Okunuki: ノ~ Bz'・'ochem.，45， 185 (1958). 4)光永俊郎，清水まゆみ:農化， 56， 7 (1982). 昭和58年12月 (1983年)5) B.F. Erlanger， N. Kokowsky and W. Cohen: Arch. Bz.ochem. Biophys.， 95， 271 (1961). 6) M.L. Anson: J. Gen. Physz'・'01.，22， 79 (1939). 7) T. Koide and T. lkenaka: Eur. ノ~ Bi・'ochem.，32， 401 (1973). 8) T. Koide and T. lkenaka: Eur.ノ".Bz.ochem.， 32， 417 (1973). 9) I.E. Liener， and M.L. Kakade:“Toxic Con-stituents of Plant Foodstuffs"， ed. by I.E. Liener， Academic Press lnc.， N ew York， 1980， pp 14-17. 10) V. Frattali: ノ• Biol. Chem.， 244， 274 (1969). 11) M. Yamamoto and T. lkenaka:ノ".Biochem.， 62， 141 (1967). 

黒大豆(Glycine max MERRILL forma Kuromame MAKINO)のトリプシンインヒビターについて(第2報) : トリプシンインヒビターの性質

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