Katagiri, Chisato

Shimizu, Mayumi

清水, まゆみ

片桐, 千里

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Kyoto Women's University Academic Repository (AIR) / 京都女子大学学術情報リポジトリ（京女AIR）

食物学会誌 ・第38号 一17黒 大 豆(Glycine max MERRILL forma Kuromame MAKINO)   の ト リプ シ ン イ ン ヒ ビ タ ー に つ い て(第1報)一 ト リプ シ ン イ ン ヒ ビ タ ー の 分 離 精 製 一一片 桐 千 里,清 水 まゆみTrypsin Inhibitors of Kurodaizu (Glycine max MERRILL        forma Kuromame  MAKING) (Part 1)  —Separation and Purification of Trypsin Inhibitors—Chisato Katagiri and Mayumi Shimizu 植物性食品中のプロテアーゼインヒビターの研究は1946年 にKunitzl>が 大豆より トリプ シンイ ンヒビターを単離 して以来,著 しい進展がみられている。現在ま で大豆2+13)を 中心 に豆類 穀類をはじめ種 々の植物性食品か ら多数のインヒビターが単離され,そ れ らの性質が明 らかにされてきた。このプロテアーゼインヒビターの研究のきっかけとなった大豆はさまざまな気象条件や土壌条件 に適応でき,品 種の選定 と適当な栽培管理を講ずれば至る所で成育が可能である。そのため,大 豆は品種の分化が進み,多 くの種類が存在 している。大豆の一品種である黒大豆は一般に黒豆 と呼ばれ,わ が国では限られた地域で生産されてお り,古くから煮豆に調理されて親 しまれている。この黒大豆にも大豆と同様に多 くの トリプシンイ ンヒビターが存在 し,予 備的に行われた実x¢14.,)では少な くとも5種 類の トリプシンインヒビターが存在していることが確認された。本研究は黒大豆の トリプシンインヒビターについて検討するため,さ らに分離精製を進めることを目的 として行 った。1.実 験1.実 験材料 黒大豆は兵庫県産丹波黒を入手 し,粉砕後,石 油工一テルで 脱脂 して用いた。 トリプシン(牛膵臓,2回 結晶)はSigma社 製品を購入 した。基 質 と して の カゼ インはMerck社 より,α 一N一ベンゾイルーDレ ァルギニンーP一ニ トロアニ リ ド塩 酸 塩京都女子大学食物学科食品学第4研 究室(食 品化学)(BANA)は 財団法人 蛋 白質研 究奨 励 会よ り入 手 した。ま た カ ラムク ロマ トグ ラフィー に 用 い たSephadexG-?5,DEAE-Sephadex A-25, CM-Sephadex C-25,QAE-Sephadex A-25はPharmacia Fine Chemicals社 の製品を使用 した。そ の他 の試薬 は市販特 級品を用いた。2. タ ンパ ク質 の定量 卵 製 アル ブ ミン(2回 結晶,NBc社 製品)を 標準 タ ンパ ク質 と して, Lowryら15)の方法 に従 った。 カ ラムか らの溶 出液 につ いて は280nmに お ける吸 光度を測定 した 。3.糖 の定量 グル コー スを標 準糖 と し,フ ェノール硫 酸法16)に より定 量 した。4. トリプ シン活性 および トリプ シンイ ンヒ ビター活  性 の測定 1) トリプシ ン活性 の測定 カゼ イ ンを基質 とする萩 原 ら の カ ゼ イ ン消化 法17)の 改 良 法18),ま た はBANAを 用い るErlangerら の方 法19)の 改良法18)によ り測 定 した。2) トリプ シ ンイ ンヒビター活 性 の測定 トリプ シン活性 の測定法の トリプ シ ン液 に イ ンヒビター 液を反応させ た後,同 様 の操 作を行 い,吸 光 度(T*)を 求 めた。 これ とイ ンヒビターを含 まな い コ ン トロール(T)か ら次式 によ り阻害度(1)を 算 出 した 。     1(00)=10a(T-T*)ノT イ ンヒビター単位 は トリプ シ ン1ｵgの 酵素活性を10000阻 害す るイ ンヒビター量(ｵg)を1単 位 と し,unitで 表 わ した。 な お,収 率 の測 定 にはカゼ イ ン消昭和58年12庁 (1983年)インヒビターの分離精製先の報告14)では 1stクロマトグラフィーとして SephadexG-75カラムによるゲ、ルろ過を行い 3つの活性画分を得たが，分離の状態はやや不十分であった。そこで今回は 1stクロマトグラフィーに DEAE-SephadexA-25カラムを用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。粗製トリプシンインヒピター 200mgを 4mlの2. - 18-化法を，その他のインヒピター活性の測定には BANA法を用いた。5. ポリアクリルアミドゲル電気泳動 Davisら20)の方法により7.5%ゲ、jレ， トリスーグリシン緩衝液 (pH8.4)中で行った。トリス一塩酸緩衝液 (pH8.0)に溶解し，同緩衝液で平衡化した DEAE-Sephadex A-25カラム(2. 5X31 cm)に加えて吸着させた。次に同緩衝液 50mlでカラムを洗浄し， NaCl濃度勾配 (0→0.5M)で溶出させた。このクロマトグラムを Fig.1に示す。7つの活性画分に分離し，それぞれ水に対して透析後，凍結乾燥した。各画分についてディスクポリアクリノレアミドゲJレ電気泳動を行った結果，画分7は単一なバンドを示し，電気泳動的に均一であった。他の画分はそれぞ、れ数種類のバンドが存在しており，部分精製物であった。画分1..._.6について，さらに SDS-ポリアクリノレアミドゲル電気泳動を行い，部分精製物としての分子量を推定したD その結果，画分1，5は分子量にして約2，000しか差がない混合物であり，他は約3，000以上差があった。そとで前者2画分はイオン交換クロマトグラフィーにより，後者4画分はゲソレろ過によりさらに精製した。0.05 M 結果および考察1. インヒビターの抽出 粉砕脱脂黒大豆に同量の海砂を加えて乳鉢で磨砕い少量の 0.1M NaCl溶液を加えてペースト状にした。さらに黒大豆重量の10倍量のO.lMNaCl溶液を加えて混合し， 40Cで2時間放置した。この混合液をろ過し，ろ液を 600Cで1分間熱処理して熱に不安定な成分を遠心分離 (8，000rpm， 10分)後，得られた上清を抽出液とした。とれに硫酸アンモニウムを0.8飽和になるまで加えて塩析を行い，生じた枕殿を水に対して透析した。透析中に生じた不溶のグロプリン系タンパク質を遠心分離 (8，000rpm， 10分)で除き，得られた液を透析液とした。透析液を凍結乾燥し，粗製トリプシンインヒビターを得た。とれらの処理でもとの活性(抽出液)の53%が失われた。乙れは主として透析により分子量10，000以下の低分子性のインヒピターが透析外液に流出したためと思われる。本研究では非透析性のインヒピターを対象としてさらに分離精製を進めた。? ?04 〆'、芝、-ノu o z 0.2 ? ? ??? ?『? ?? ?? 』? ?? ???100 .-‘・I 、11 1.0 0.5 ????〈。。75 50 25 。Tube N。DEAE・SephadexA-25カラムによる粗製トリプシンインヒビターの溶出パターン。粗製トリプシンインヒビター 200mgを0.05Mトリス一塩酸緩衡液 (pH8.0) 4 mlに溶解し，同緩衝液で平衡化したカラム (2.5X31 cm)に加え吸着させた。同緩衝液50mlでカラムを洗浄した後， NaCl濃度勾配 0→0.5M で溶出させた。流速は16ml/hr， 1 tube 5 gとした。一一， 280 nmの吸収;一一一， トリプシンインヒビター活性;ー -ー， NaCl濃度。Fi岳.1.-19 -食物学会誌・第38号???? ?〉?????? ???? ?100 50 60 0.6 0.3 ????《。40 30 20 10 。N。Sephadex G-75カラムによる画分6の溶出パターン。画分660 mgを0.05Mグリシン戸水酸化ナトリウム緩衝液 (pH9.5) 2 ml に溶かし， 同緩衝液で平衡化したカラム(2.5X65 cm)に加え同緩衝液で溶出させた。流速は 2mljhr， 1 tube 5 gとした。一一， 280 nrnの吸収;ーー-，トリプシンインヒビター活性。Tube Fi岳.2. Sumrnary of Puri五cationof Trypsin Inhibitors (from Kurodaizu 50g) Total protein Total unit Specific activity Yield Step(μgX 10-3) (unitX 10-3) (unit/μg protein) (%) Extract 6811. 0 3868.4 0.57 100.0 Dialysate 1130. 0 1808. 0 1. 60 46. 7 1st Chromatography Fraction 7 2nd Chromatography Fraction 1a 1b 2 3a 3b 4 5b 9.0 ???????????.• ??????????1. 56 2. 78 2.17 3.45 2.94 1. 78 1. 92 2.44 349.4 9.3 21. 2 70. 2 24. 1 10.2 7. 8 100. 7 224.3 3.3 9.8 20.4 8. 2 5. 7 4.0 41. 3 Table 1. 2. 1 5. 7 6.5 5.00 3.03 4.55 82. 7 220. 7 252.8 16.5 72.6 55.6 3rd Chromatography Fraction 5a 6a 6b 26. 2 Total yield 昭和58年12月 (1983年)100 ? ? ? ? ?0.4 0.2 - 20ーf司、訳、ーノ泳場闘〉喝・u 《50 >. ‘-。司伽同.0 .c c ??? ?〈。。40 30 Tube N。[A] 20 。0.3 0.2 ~ u O Z 0.1 ??????????????0.4 ε z o ∞ 2 02 。。30 20 10 。N。Tube [sJ QAE-Sephadex A-25カラムによる画分 6a， 6 bの溶出パターン。画分 6aまたは6 b 25 mgを 0.05M グリシンー水酸化ナトリウム緩衝液 (pH9.5) 2 ml に溶解し，同緩衝液で平衡化したカラム(1.5X25 cm)に加え吸着させた。同緩衝液 20mlでカラムを洗浄した後， NaCl濃度 O→0.5Mで溶出させた。流速は 9mljhr， 1 tube 3gとした。 CA]は画分 6a， CB]は画分6bの溶出パターンを示す。一一一， 280nm の吸収;一一ー ， トリプシンインヒピター活性;一一一， NaCl濃度。Fi岳.3. クロマトグラフィーを行った。画分 5aは SephadexG-75カラムによるゲJレろ過，画分 6a，6bは QAE-SephadexA -25カラムによるイオン交換クロマトグラフィーを行い，活性画分を得た。以上の分離精製のうち，画分6についての結果を示すと Fig.2，3のとおりである。画分6を 60mgとそれぞれ均一な画分1については CM-SephadexC-25カラムを用いて活性画分 1aと1bに，画分5は QAE-SephadexA-25カラムを用いて画分 5aとめに分画した。 2，3， 4， 6画分はそれぞれ SephadexG-75カラムにより，活性画分 2，3a， 3b， 4， 6a， 6bを得た。これらの画分はディスク電気泳動を行うと， 5a， 6a， 6b Iこ複数のバンドが認められたので，さらにこれらについて食物学会誌・第38号り 0.05 M グリシンー水酸化ナトリウム緩衝液 (pH9.5) 2 mlに溶かし，同緩衝液で平衡化した Sepha-dex G-75カラムに添加レ溶出させると， 2活性画分6a， 6bを得た (Fig.2)。両画分をさらに QAE・Se-phadex A-25カラムで分離すると， 6aは NaCI濃度0.25 M IC活性画分が溶出し (Fig.3 CA])， 6bは0.17M に溶出した (Fig.3 CBJ)。Table 1はとれらの分離精製の結果をまとめたものである。黒大豆 50gより抽出した液の総インヒピター活性は3，868， 400 unitであったが，乙れは小麦種子各部位(要富山，旺芽2へ匠乳22))を例にとって比較してみると，約140"，-，600倍と非常に高い数値を示し，比活性も 60"，-，120倍と極めて強い値であった。各過程の精製度を比活性でみると，熱処理，塩析，透析の操作で3倍IC，各クロマトグラフィーにより単離された11種のトリプシンインヒピターは3，，-， 9倍に精製された。乙れらのインヒビターは糖を含まない，アミノ酸のみからなるタンパク質であった。また，収率では，塩析，透析過程で53%が失われ，低分子量のインヒピターの存在を示した。黒大豆にも大豆と同じインヒビターが含まれると考えられiへこの損失の際にBowman-Birkタイプのインヒピターも失われたのではないかと思われる。とのように黒大豆にも大豆と同様，多量にしかも多種のトリプシンインヒビターが存在するととは，遺伝的不均一性による23〉，大豆の品種に遺伝的変異がある24)などと考えられているが，推測の域を出ず，今後の検討が待たれる。本研究を行うにあたり，御指導下さいました本学光永俊郎教授に深く感謝いたします。参考文献1) M. 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黒大豆(Glycine max MERRILL forma Kuromame MAKINO)のトリプシンインヒビターについて (第1報) : トリプシンインヒビターの分離精製

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