CD-T 581.634 A14; 41 pEl grupo de investigación MICROBIOTEC dentro de sus líneas de investigación comprende la seguridad alimentaria y la biotecnología, y desde algunos años atrás ha trabajado en el conocimiento de sustancias con capacidad antimicrobiana y en el mejoramiento de la calidad de los productos de la agroindustria. En el deseo de continuar en la búsqueda de moléculas con estas propiedades, se propuso realizar una pasantía para realizar un trabajo de investigación buscando en hojas de morera, ya que esta es una plata muy resistente al ataque de fitopatógenos, sustancias que le otorguen la capacidad de controlar diferentes patógenos microbianos, contribuyendo así a las líneas pertenecientes al grupo de la universidad.Universidad Libre Seccional Pereir

Arango Montoya, Keren María

Urrea Giraldo, Alvaro Esteban

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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE EXTRACTOS DE MORERA (Morus spp)  EN CEPAS DE MICROORGANISMOS PATÓGENOS  DE INTERES CLÍNICO Y AGROINDUSTRIAL Autores: Keren María Arango Montoya Alvaro Esteban Urrea Giraldo Asesor: Duverney Gaviria Arias GRUPO DE INVESTIGACIÓN LÍNEA DE INVESTIGACIÓN CENBIOTEP MICROBIOTEC Biotecnología Vegetal Seguridad Alimentaria Biotecnología INTRODUCCIÓN  • La  medicina convencional ha demostrado la relación de extractos de plantas ricos en fitoquímicos para curar diferentes enfermedades  y desde tiempo atrás se van venido usando para el tratamiento de las mismas, adicional al recurso que son como alimento y follaje para muchos seres vivos.  • En la actualidad  existe un gran interés en la búsqueda de compuestos biológicos activos como fuentes para fármacos útiles en enfermedades infecciosas.  • Existe una creciente demanda por parte de la sociedad industrializada en el uso de plantas como medicinas para identificar los diferentes compuestos antioxidantes, entre otros y a partir de estos producir nuevos fármacos potenciales en el uso de la  medicina, lo que ha llevado a la extracción y obtención de extractos, aceites esenciales, para la fabricación de  medicamentos y quimioterapéuticos a partir de ellas.     1,6, 17,18     • La Morera debido a sus características como forraje, su buena capacidad de producción de biomasa, composición química, alta degradabilidad, adaptabilidad a diversas condiciones de clima y suelo, perennidad ante el corte y disponibilidad  es una de las más importantes en este campo.   • Con el fin de optimizar el uso de esta planta se han realizado diversos estudios donde se han descubierto múltiples actividades como actividad antioxidante, antiinflamatoria, antimicrobiana, antiglucemiante, anti ulcerosa, entre otras, debido a los metabolitos que ella produce.    1, 2, 6   INTRODUCCIÓN Morera • La morera es un árbol perteneciente a la familia Moraceae, se subdivide en 4 subfamilias, 55 géneros, 950 especies.  • La familia Moraceae es una de las más interesantes en uso de productos naturales con propiedades cosmeceúticas, ya que a partir de las especies de Morus se ha podido lograr la extracción de diversos tipos de metabolitos secundarios de tipo polifenólico como rutinina, isoquercetina y astragalina.   En términos de producción tiene 3 especies principales:  • Blanca (Morus alba) • Roja (Morus rubra) • Negra (Morus nigra)  3, 4, 5   INTRODUCCIÓN Morera   • El  principal campo donde se ve el cultivo y uso de la morera, es la sericultura.   • Hasta el momento no se ha publicado estudios realizados para determinar la composición y propiedades químicas de Morera en Colombia.         5  INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA • Los antibióticos son la base principal para la terapia de infecciones microbiana (bacterias y hongos).   • La aparición en el mundo de bacterias como Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus y muchos otros productores de ß-lactamasa se ha convertido en un problema terapéutico importante.   • También se ha datado sobre biopeliculas (biofilms) en la industria de alimentos las cuales pueden generar contaminación y el uso de biosurfactates aislados de diferentes microorganismos con potencial antimicrobiano.  • Estudios han mostrado CMI (Concentración Mínima Inhibitoria) de Morus alba frente a los patógenos B.subtilis, B.cereus, S.aureus, E.coli,  en la mayoría de los casos 8, 12, 15 PROBLEMA QUE MOTIVO EL ESTUDIO DE CASO El grupo de investigación MICROBIOTEC dentro de sus líneas de investigación comprende la seguridad alimentaria y la biotecnología, y desde algunos años atrás ha trabajado en el conocimiento de sustancias con capacidad antimicrobiana y en el mejoramiento de la calidad de los productos de la agroindustria. En el deseo de continuar en la búsqueda de moléculas con estas propiedades, se propuso realizar una pasantía para realizar un trabajo de investigación buscando en hojas de morera, ya que esta es una plata muy resistente al ataque de fitopatógenos, sustancias que le otorguen la capacidad  de controlar diferentes patógenos microbianos, contribuyendo así a las líneas pertenecientes al grupo de la universidad.  PREGUNTA QUE GUIÓ EL ESTUDIO DE CASO ¿Será posible identificar moléculas con capacidad antimicrobiana en extractos de Morera (Morus spp)? OBJETIVO GENERAL Identificar la actividad antimicrobiana de extractos de hoja de 11 variedades de morera de la granja experimental “El Pílamo”  OBJETIVOS ESPECÍFICOS • Evaluar los diferentes solventes  • Establecer protocolos para la extracción de sustancias con capacidad antimicrobiana  • Determinar la actividad antimicrobiana de los extractos   METODOLOGÍA Búsqueda de la literatura:  • Gestor de referencias EndNote: 70 (10) • Bases de datos dentro del NCBI: 423 (15) • Google Académico 6.420 (25) • Bases de datos de la universidad, ProQuest 260 (25)  • Artículos suministrados por docentes 50 (30)   Términos usados: • Mulberry • Morus • Antimicrobial activity  Operadores lógicos: OR y AND  MATERIAL VEGETAL • Nacional   • KANVA 2 • Kaevian Pong • IS26 • Taig Song • S-18 • Subong Pong • Tamarina • S-3 • AA-2 • S-9 MATERIALES Y MÉTODOS EXTRACCIÓN Metanol ▪ Agua  70:30 Acetona ▪ Agua  70:30 Solventes Temperatura Temp. Ambiente Aprox. 23°C Baño frio Aprox. 7°C Tiempo 15 Seg. 30 Seg. Extracción por Ultrasonido • 5 veces x 15 Seg. • 5 veces x 30 Seg. • 5 veces x 30 Seg. (En baño frio)  MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES Y MÉTODOS Preparación extractos Macerado 0,5g hoja seca + 20mL de solvente (MeOH:H2O Ac:H2O) Extracción por Ultrasonido: 5 veces por 30sg triplicado Rotaevaporación % de extracto seco EXTRACCIÓN MICROORGANISMOS A EVALUAR • Escherichia coli. Gram - • Bacillus subtilis. Gram + • Bacillus cereus. Gram + • Staphylococcus aureus. Gram + • Klebsiella pneumoniae. Gram + MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES Y MÉTODOS EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA Control positivo  Antibióticos:  • Bacitracina  Basado en: M.O. Omidiran ,et al. Phytochemical Analysis, Nutritional Composition and Antimicrobial Activities of White Mulberry (Morus alba). Pakistan J. of Nutrition. 2012.  • Ampicilina Basado en: Nauman khalid et al. Antimicrobial activity, phytochemical profile and trace minerals of black mulberry (Morus nigra l) fresh juice. Pakistan Journal of Botany. December 2011. 43: 91-96  • Cloranfenicol Basado en: Nauman khalid et al. Antimicrobial activity, phytochemical profile and trace minerals of black mulberry (Morus nigra l) fresh juice. Pakistan Journal of Botany. December 2011. 43: 91-96  Prueba de susceptibilidad  MIC / Método de dilución   Basado en: M.O. Omidiran et al. Phytochemical Analysis, Nutritional Composition and Antimicrobial Activities of White Mulberry (Morus alba). Pakistan J. of Nutrition. 2012.  Tubos con 0,5mL de extracto a diferentes concentraciones + 2mL caldo inoculudos con bacteria 0,5Mc Farland Incubar a 37°C por 24h Observar turbidez tubos Control  Ensayo por triplicado MATERIALES Y MÉTODOS EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA Halos Método de difusión  Pozos con 100uL de bacteria al 1 McFarland  Incubar a 37°C por 24h Medición diámetros halos de inhibición Control Ensayo por triplicado MATERIALES Y MÉTODOS EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA Basado en:  Nauman khalid et al. Antimicrobial activity, phytochemical profile and trace minerals of black mulberry (Morus nigra l) fresh juice. Pakistan Journal of Botany. December 2011. 43: 91-96 RESULTADOS  • Se obtuvieron valores más altos en el ensayo en frío  • No se observó diferencia entre los dos tiempos usados en la extracción  • Hay un aumento de los valores con Ac:H2O  • Se obtuvieron extractos secos de dos variedades de las 11 a estudiar  RESULTADOS ESPERADOS • Determinar las mejores condiciones dentro de las variables estudiadas para la obtención de los extractos.  • Obtener un protocolo estandarizado para la obtención de extractos y ensayos de actividad antimicrobiana  • Una inhibición de la mayoría de las bacterias usadas por parte de los extractos de hojas de morera   CONCLUSIONES • Se observó que dentro de las variables usadas, el tiempo es la única que no influye en los valores de % de extracto seco  • El uso de frío a pesar de dar valores más altos no se continúa haciéndolo de esa manera por el desgaste que genera hacerlo  • Se deben realizar más ensayos para determinar cual es el mejor solvente     PASANTIA CENBIOTEP Capacitación y rotación en el laboratorio por las áreas:  • Inducción al laboratorio y preparación de soluciones • Genómica • Medicina regenerativa • Química de proteínas • Biotecnología vegetal  PASANTIA CENBIOTEP Capacitación y rotación en el laboratorio por las áreas:  • Inducción al laboratorio y preparación de soluciones  PASANTIA CENBIOTEP  • Genómica – EXTRACCION ADN – PCR – DIGESTIÓN ENZIMÁTICA PASANTIA CENBIOTEP Extracción de ADN   PASANTIA CENBIOTEP Electroforesis de los resultados de la extracción de ADN   PASANTIA CENBIOTEP Electroforesis de los resultados de PCR    1    2   3    4    5    6   7   8   9      PASANTIA CENBIOTEP Electroforesis de la digestión enzimática  •  e PASANTIA CENBIOTEP • Medicina regenerativa – MANEJO ESTERIL – SEPARACIÓN CELULAS – SUBCULTIVOS  PASANTIA CENBIOTEP Células neuroblastoma SH SY5Y   PASANTIA CENBIOTEP • Química de proteínas – METODO CUNTIFICACION PROTEINAS • Biotecnología vegetal – CULTIVO IN VITRO – EVALUACION METABOLITOS SECUENDARIOS EN MORERA  PASANTIA CENBIOTEP Evaluación metabolitos secundarios de Morera / Extracción  PASANTIA CENBIOTEP Extracción por ultrasonido   Determinación de polifenoles Basado en: Current Protocols in Food Analytical Chemestry / Método Folin-Ciocalteu Se realizó la determinación de polifenoles de los extractos obtenido basados en Método de Folin-Ciocalteu   Cálculos en Excel  % de Extracto seco RECOMENDACIONES  • Continuar con el apoyo de realizar diferente tipos de acercamientos (pasantías, cursos, trabajos de grado, etc.) a centros de investigación.   • Aún se debe realizar más estudios para conocer los compuestos químicos principales responsables de la actividad y su valor para la salud humana y vegetal tanto de la Morera como de otras plantas que se tenga información de una posible actividad.    BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA 1. Horaria Lucy, DaSilva Edgar J. Medicinal plants: A re-emerging health aid. Electron. J. Biotechnol.   1999. Vol 2, No 2.   2. Venkatesh kumar R. And Seema chauhan. Mulberry: life enhancer. Journal of Medicinal Plants Research. October, 2008. Vol. 2(10), pp. 271-278  3. Manuel D. Sánchez. Mulberry: an exceptional forage available almost worldwide. World animal review, 2000, 93(1).  4. Nauman khalid et al. Antimicrobial activity, phytochemical profile and trace minerals of black mulberry (Morus nigra l) fresh juice. Pakistan Journal of Botany. December 2011. 43: 91-96  5. Gaviria-Arias Duverney, et al. Diversidad genética en el banco de germoplasma de morera [Morus spp. (rosales: Moraceae)] de la granja experimental ''el pílamo'', universidad tecnológica de Pereira, Pereira (Risaralda), Colombia. Actu biol. 2012  june. 34 (96):33-42  6. Díaz M, Pérez Y, Cazaña Y, Prieto M, Wencomo H, Lugo Y. Determinación de antioxidantes enzimáticos en variedades e híbridos de Morus alba. Pastos y Forrajes 2013. vol. 33, núm. 3  7. Yihai wang et al. Antidiabetic and antioxidant effects and phytochemicals of mulberry fruit (Morus alba l.) polyphenol enhanced extract. PLoS One. 2013; 8(7) BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA 8. Annie S. Kao, et, al. The Epidemiology of Candidemia in Two United States Cities: Results of a Population-Based Active Surveillance.  Clinical Infectious Diseases. 1999. Volume 29(5):1164-1170.  9. Lizcano, Ramón. Andrea, Vergara, Gonzales. Jenny.  Evaluación de la actividad antimicrobiana de los extractos etanólicos y/o aceites esenciales de las especies vegetales Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata frente a microrganismos patógenos y fitopatógeno. Tesis Pregrado. Pontificia Universidad Javeriana 2008  10. Tirupathi Rao G, et, al. Anti-microbial principles of selected remedial plants from Southern India. Asian Pac J Trop Biomed. 2011 Aug; 1(4): 298–305.  11. Muhammad Ali Khan, et, al. A comparative study on the antioxidant activity of methanolic extracts from different parts of Morus alba L. (Moraceae). BMC Research Notes 2013, 6:24  12. Mohamed Z,  et al. Biological activity of extracts from Morus alba l., albizzia lebbeck (l.) Benth. and Casuarina glauca Sieber against the growth of some pathogenic bacteria. International Journal of Agricultural and Food Research. 2013.  Vol. 2 No. 1, pp. 9-22  13. Rosina khan et al. Antimicrobial activity of five herbal extracts against multi drug resistant (mdr) strains of bacteria and fungus of clinical origin. Molecules 2009. 14(2), 586-597 BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA 14. Linghong Liang, et, al. Chemical composition, nutritional value, and antioxidant activities of eight mulberry cultivars from China. Pharmacogn Mag 2012. 8(31): 215–224  15. Cortés-Sánchez, et al. Surfactantes biológicos con aplicación potencial en tecnología de alimentos: una revisión.  Biológicas, Julio, 2013. 15(1): 16 – 23  16. R. K. Datta, Mulberry Cultivation and Utilization in India. FAO Electronic Conference on Mulberry for animal production (Morus1-L).  17. M.O. Omidiran ,et al. Phytochemical Analysis, Nutritional Composition and Antimicrobial Activities of White Mulberry (Morus alba). Pakistan J. of Nutrition. 2012. 11 (5): 456-460.    18. Muhammad Shoaib Zafar, et al. White Mulberry (Morus alba): A Brief Phytochemical and         Pharmacological Evaluations Account. International journal of agriculture & biology. 2013.           15(3):612–620.   AGRADECIMIENTOS   • A la Universidad Libre de Pereira por la oportunidad de realizar la pasantía en el Centro de Biología Molecular y Biotecnología de la Universidad Tecnológica de Pereira.  • A la Decana de la Facultad María Teresa Rodríguez, a la Docente Elizabeth Castaño Moreno y a la Directora de Investigaciones Julia Inés Escobar por la facilitar los medios para que el convenio se llevara a cabo.   • Al docente Duverney Gaviria por apoyarnos en el proceso de la elaboración de este proyecto, compartir sus conocimientos y experiencia con nosotros. De igual forma a todo el personal de CENBIOTEP  • Centro de Biología Molecular y Biotecnología de la Universidad Tecnológica de Pereira CENBIOTEP y a todas las personas que participan dentro de él por su presto recibimiento, apoyo y acompañamiento durante el tiempo en el lugar.     

Evaluación de la actividad antimicrobiana de extractos de morera (Morus spp) en cepas de microorganismos patógenos de interés clínico y agroindustrial

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