Orientador : Profª. Joana Lea Meira SilveiraCoorientadores : Prof. Jaime PabaTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 30/10/2015Inclui referênciasResumo: Fungos da podridão da madeira compreendem organismos com a habilidade de degradar substratos lignocelulósicos. Eles secretam uma variedade de enzimas com potencial aplicação industrial na produção de papel, indústria textil, bioremediação e síntese orgânica. Explorando-se o potencial biotecnológico dos fungos, este trabalho apresenta a descrição do perfil de secreção proteica do fungo Lentinus crinitus e a utilização de uma lacase de Lepista sordida para descoloração de corantes têxteis, bem como a descrição parcial do gene que codifica para esta enzima. A fim de se obter um perfil de proteínas de secreção de L. crinitus, o fungo foi cultivado em meio contendo concentração variável de fontes de carbono, nitrogênio e teor de água. O perfil de proteinas secretadas mudou drasticamente em complexidade e intensidade de acordo às condições de cultivo, sendo que as culturas líquidas usando altas concentrações de maltose e ureia resultaram no perfil com maior número e intensidade de bandas proteicas na eletroforese unidimensional. Uma mistura de extratos de secreção provenientes de culturas com maltose e ureia em diferentes condições foi analisada via cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS) e eletroforese bidimensional (2D-SDS-PAGE). O espectro de proteínas identificadas (98 proteínas) inclui vários tipos de CAZymes (carbohydrate-active enzymes), oxidoreductases, proteases, esterases, proteínas com funções não relacionadas, classificadas como proteínas "miscelânea" e finalmente proteínas hipotéticas ou desconhecidas. Embora a prévia separação dos extratos solúveis por eletroforese bidimensional tenha melhorado o número de proteínas identificadas (150 spots correspondendo a 171 identificações), as duas estratégias revelaram uma distribuição semelhante de proteínas em cada grupo funcional de classificação proteica. A análise de bandas proteicas expressas particularmente em culturas com baixo teor de água mostra que o cultivo em estado sólido favorece a expressão de oxidases tais como lacases, manganês peroxidases, glucose-metanol-colina oxidoreductases e glioxal oxidases. A diversidade de proteínas observadas nos extratos de secreção de L. crinitus revela neste fungo um poderoso arsenal de enzimas envolvidas na quebra e consumo de lignocelulose e com possíveis aplicações biotecnológicas. O segundo basidiomiceto analisado foi um isolado de L. sordida. Os extratos de secreção derivados do fungo apresentaram atividade descorante contra diversos corantes têxteis e esta capacidade foi associada à produção de um par de polipeptídeos com atividade de lacase. Os extratos enzimáticos brutos demonstraram boa atividade e estabilidade em temperaturas entre 20 a 50 °C e em valores de pH entre 3,0 a 5,0. As culturas contendo maltose e nitrato de sódio, como fontes de carbono e nitrogênio, resultaram em uma melhor produção da enzima, e esta produção permaneceu inalterada quando houve suplementação com íons metálicos. Por fim, a introdução de mediadores redox (siringaldeído e acetosiringona) nos ensaios enzimáticos permitiu uma descoloração eficiente de 12 substratos. Com o intuito de obter informações sobre a estrutura primária do gene da lacase, sequências de nucleotídeos pertencentes a domínios conservados da enzima foram usadas em diferentes estratégias de amplificação via PCR e sequenciamento. Como resultado, uma sequência parcial do gene correspondendo a 1.519 nucleotídeos foi obtida. Esta sequência codifica para 386 aminoácidos, possui identidade com várias multicobre oxidases e contém 6 introns e 7 exons, assim como 4 potenciais sítios de glicosilação. Palavras chave: lacase, secretoma, biodegradação, tratamento de efluentes, enzimas lignocelulósicas, Lepista sordida, Lentinus crinitus.Abstract: Wood-rotting fungi are organisms with the ability to degrade lignocellulolytic substrates. They secrete a variety of enzymes with several industrial aplications in the production of biofuels, paper, textil industry, bioremediation and organic synthesis. In the present work the biotechnological potential of two local lignolytic basidiomycetes, Lentinus crinitus and Lepista sordida was assessed. Thus, the profile of secreted proteins produced by L. crinitus was determined and the catalytic properties of a laccase derived from Lepista sordida as well as the partial primary structure of the corresponding gene are presented. To study the protein secretion profile of L. crinitus, the fungus was grown in diferent culture media with variable carbon, nitrogen and water content and the resulting soluble extracts analysed by gel electrophoresis. The secretion profile changed drastically in complexity and intensity according with culture conditions. Liquid cultures with high concentration of maltose and urea resulted in secretion extracts with the higher number of protein bands and intensity in SDS-PAGE. A mixture of secretion extracts derived from different maltose and urea culture conditions was analysed by liquid chromatography coupled to mass spetrometry (LC-MS) and by two-dimensional electrophoresis (2D SDS-PAGE). The identified proteins (98) included several CAZymes (carbohydrate-active enzymes), oxidoreductases, proteases, esterases, proteins with unrelated functions (classified as miscellany) and a group of hypothetical proteins. Separation of soluble extracts by 2D electrophoresis improved the number of identified proteins (150 spots corresponding to 171 IDs), both strategies revealed a similar protein distribution in functional classes. Additionally, the analysis of particularly expressed protein bands in cultures with low water content showed that solid state cultivation favores the expression of oxidases such as laccases, manganese peroxidases, glucose-methanol-choline oxidoreductases and glyoxal oxidases. The observed protein diversity in the soluble extracts of L. crinitus reveals a powerful arsenal of enzymes involved in the breakdown and consumption of lignocellulose, with large biotechnological applications. L. sordida secretion extracts displayed high destaining activity against several colored substrates and this capacity was related to a pair of polypeptides with laccase activity. Crude enzymatic extracts demonstrated good activity and stability at pH and temperatures between 3.0 to 5.0 and 20 to 50 °C, respectively. Cultures containing maltose and sodium nitrate as carbon and nitrogen sources resulted in the best enzyme production. Finally, the introduction of redox mediators, syringaldehyde and acetosyringone, in enzyme assays allowed efficient destaining of 12 dye substrates. In order to obtain primary structure information of the laccase gene, nucleotide sequences belonging to enzyme conserved domains were used in several amplification and sequencing strategies. As a result a partial gene sequence corresponding to 1,519 nucleotides was obtained. This sequence encodes 386 amino acids, it has identity with several multi-copper oxidases and contains 6 exons and 7 introns, as well as 4 potential glycosylation sites. Keywords: laccase, secretome, biodegradation, waste-water treatment, lignocellulolytic enzymes, Lepista sordida, Lentinus crinitus
