Experimente zur Übertragung von Rebenviren durch Schildläus

Herrbach, Etienne

Hoffmann, Christoph

Hommay, Gerard

German

Archive Ouverte en Sciences de l'Information et de la Communication

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Experimente zur Übertragung von Rebenviren durch Schildläuse 
(Versuchsprotokoll der INRA, UMR SVQV Colmar, 
 im Rahmen des Interreg 2016-2018 Projektes „InvaProtect“) 
Der Sinn dieser Anleitung ist es, Versuchsaufbau und Versuchsbedingungen im Hinblick auf die 
Bestimmung der Übertragungseffizienz der Vektoren bei Virusübertragungsexperimenten mit 
Blattrollviren nachvollziehbar zu beschreiben. Sie richtet sich an die Projektpartner des InvaProtect 
Projektes, die beabsichtigen, selbst solche Experimente durchzuführen. Von dieser Anleitung gibt es 
auch eine französische Version. Sie geht auf die zwei folgenden Versuchsarten ein: 
I. Virusübertragung unter kontrollierten Bedingungen um die Übertragungseffizienz oder 
deren Variabilität unter Laborbedingungen zu prüfen. 
II. Natürliche Infektiosität von Schildläusen, die direkt aus dem Weinberg entnommen 
wurden, mit dem Ziel, das Übertragungspotential von Vektorpopulationen 
unterschiedlicher Herkünfte zu ermitteln. 
Generell laufen Übertragungsexperimente in folgender Reihenfolge ab: 
• Akquisitionsphase (acquisition access period, AAP) = Phase, in der das Insekt (Schildlaus) und 
die Virusquelle (infizierte Pflanze) in Kontakt sind. Dabei saugt das Insekt an der Pflanze und 
nimmt das Virus auf. Bei Experimenten vom Typ I. ist die Länge dieser Phase standardisiert, bei 
jenen vom Typ II. ist sie unbekannt. 
• Inokulationsphase (inoculation access period, IAP) = Phase, in der das Insekt, das zuvor das 
Virus aufgenommen hat, mit einer gesunden Pflanze (getestet) mit dem Ziel der Übertragung 
der Erreger in Kontakt gebracht wird. 
• Inkubationsphase = Phase, in der die Pflanze im Labor oder im Gewächshaus inkubiert werden 
muss, bis das Virus erstmalig nachweisbar ist (ELISA/PCR). Dieser Nachweis gibt Aufschluss 
darüber, ob eine Übertragung stattgefunden hat oder nicht. 
 
I. Virusübertragung unter kontrollierten Bedingungen 
Voraussetzungen für diese Art von Experiment sind: 
• Schildläuse, die im Ausgangszustand des Versuches noch kein Virus aufgenommen haben 
(Laboraufzucht, Eier bei oviparen Arten, oder Individuen, die von einem nachweislich nicht 
Virus infizierten Stock entnommen wurden). 
• Eine Virusquelle (= Herkunftspflanze der Viren) für Akquisitionsphase (Blätter oder Stecklinge 
einer positiv getesteten Pflanze). 
• Junge nachweislich virusfreie Pflanzen (Testpflanzen), die in Gewächshäusern mittels 
Stecklingsvermehrung oder als Sämlinge hergestellt wurden und für die Inokulation mit 
Schildläusen verwendet werden, die das Virus bereits akquiriert haben. Die Anzahl der 
bereitzustellenden Pflanzen (Wiederholungen) richtet sich nach der geplanten Zahl der zu 
prüfenden Schildläuse (20-30 Tiere pro Pflanze). Wenn es sich bei den untersuchten Viren um 
ein Vitivirus (GVA, GVB, …) handelt, ist es möglich, als Testpflanzen auch krautige Pflanzen, die 
das entsprechende Virus vermehren, zu verwenden (Nicotiana benthamiana, N. clevelandii. 
Vorsicht: Man sollte hier besonders junge Exemplare dieser Pflanzen verwenden, weil ältere 
Haare ausbilden, die die Bewegungsfreiheit der Schildläuse erheblich einschränken können). 
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Im Idealfall sollte das Virus in der Virusquelle sowie die Abwesenheit des Virus in der Testpflanze vor 
jedem Übertragungsexperiment mit ELISA nachgewiesen werden. Vorsorglich können Virusquelle und 
Testpflanzen regelmäßig mit einem wirksamen Insektizid behandelt werden, um ungewollte 
Übertragungen auszuschließen. Diese Behandlungen sollten spätestens ein Monat vor Versuchsbeginn 
abgeschlossen werden. 
 
Die Akquisition des Virus erfolgt meistens von einem Blatt, das von einer infizierten Pflanze 
entnommen wird, und seltener von einer ganzen Pflanze. Die entnommenen Blätter werden am Leben 
gehalten, indem man ihre Stiele mit feuchter Watte und Parafilm® umwickelt und sie in einem 
geschlossenen Gefäß aufbewahrt (z. B. Butterdose, Petrischale, …). Werden ganze Pflanzen verwendet, 
werden diese in individuelle Tüten vereinzelt (z.B. Breadbag®). Der Vorrat virusfreier Schildläuse wird 
im Labor entweder frei auf virusfreien Pflanzen gehalten oder in kleinen anklemmbaren Käfigen (Clip-
Käfige, kleine Petrischale) an Blättern. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Eine weitere Variante kann mit Eiern oviparer Arten durchgeführt werden (z. B. Parthenolecanium 
corni), die aus den abpräparierten Schilden der eierlegenden Weibchen ausgesiebt werden. Für die 
Akquisition kann man verschiedenen Vorgehensweisen wählen: 
• Man verwahrt die Eier in geschlossenen Behältnissen auf einem Blatt, das von der als 
Virusquelle dienenden Pflanze entnommen wird, bis die Larven schlüpfen (Fig. 1). Nach 
Schlüpfen und Festsaugen der Larven setzt man zur Inokulation das Blatt, oder Teile davon, 
auf gesunde Test-Pflanzen wie nachstehend beschrieben. 
• Man gibt die Eier in festklemmbare Minikäfige und lässt die Larven direkt auf der als 
Virusquelle dienenden Pflanze schlüpfen (Fig. 2). 
Einen Teil derselben Population hält man separat bei gleicher Temperatur, um die Schlüpfdynamik der 
Population zu beobachten.  
Die maximale Dauer der Akquisitionsphase sollte zwischen 2 bis 4 Tagen liegen. Im Anschluss daran 
kann mit Hilfe einer RT-PCR mit 10 Individuen getestet werden, ob das Virus von den Larven 
aufgenommen wurde.  
 
 
Fig 1.  Akquisition des Virus durch 
die Schildlaus an einem Blatt einer 
virösen Pflanze, die beide in 
einem Plastikgefäß am Leben 
gehalten werden. 
 
 
Fig. 2.  Aquisitionsphase des Virus 
durch die Schildlaus am Blatt 
einer viruspositiven Pflanze mit 
hilfe eines Clip-Käfigs. Die selbe 
Technik kann auch bei der 
Inokulationsphase verwendet 
werden (Fig. 3)  
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Inokulation: Nach der Akquisitionsphase werden die vermeintlich virustragenden Schildläuse von der 
Virusquelle (Blatt, Pflanze) auf die Testpflanze übertragen. Dies geschieht in einem Gefäß, um die 
unkontrollierte Verschleppung der virustragenden Insekten zu verhindern. Dieser Vorgang wird 
entweder mit Hilfe einer Präpariernadel oder einer feinen Pinzette vollzogen, die es ermöglichen, die 
Schildläuse einzeln zu übertragen, oder man schneidet das Blatt mit den Schildläusen in kleine Stücke, 
die die gewünschte Anzahl an Tiere beherbergen, die man nun zum Beispiel in einen Clip-Käfig geben 
kann, der an der Testpflanze befestigt wird (Fig. 3) oder als Blattstück direkt an die Pflanze geklemmt 
wird (Fig. 4). Die letztgenannte Methode ist für das Insekt die schonendste. Ein Minimum von 20-30 
Tieren pro Testpflanze wird empfohlen. Die Testpflanzen werden nun in PVC-Zylindern gehalten, die 
mit Gaze oder verschließbaren Brotsäcken (Breadbag®) verschlossen werden. Diese bleiben für die 
Dauer der Inokulation so eingeschlossen auf einem mit Kulturlicht versehenen Pflanztisch bei 
Langtagbedingungen (16h/8h) stehen. Die Temperatur sollte dabei zwischen 23 und 25°C liegen.  
 Es ist wichtig die Behältnisse, in denen die Übertragungsarbeiten stattfinden, nach jedem 
Wechsel (Virusisolat, Vektorspezies oder -herkunft) mit heißem Wasser auszuwaschen und sich selbst 
die Hände mit Seife zu waschen. Bei Übertragungsversuchen sollte man immer damit beginnen, die 
gesunden Kontrollpflanzen zu inkubieren, auf die keine virustragenden Schildläuse übertragen werden 
oder die mit nicht virustragenden Schildläusen inokuliert werden sollen. Nach jedem Arbeitsschritt 
sollte die Arbeitsplatte mit Alkohol desinfiziert werden, um zu garantieren, dass sich keine Schildläuse 
mehr darauf befinden. 
 Am Ende der Inokulationsphase werden die Säckchen vorsichtig abgezogen und die Zahl der 
auf der Pflanze festgesaugten Schildläuse gezählt oder geschätzt, wenn mehr als 30 Tiere vorliegen. 
Die Pseudococciden werden am besten abgesammelt, um entweder abgetötet oder in Röhrchen für 
eventuell später stattfindende Tests konserviert zu werden. Um alle Schildläuse auf den Testpflanzen 
sicher abzutöten, werden diese anschließend unter einem Abzug mit einem Insektizid behandelt. Diese 
Pflanzen werden nun bis zum Virusnachweis in einer extra Gewächshauskammer gehalten, die 
physisch getrennt ist von der Anzucht der Testpflanzen und jener Pflanzen, die als Virusquelle dienen. 
Hier werden regelmäßig Insektizidbehandlungen durchgeführt. 
 
  
 
Fig 3.  Virusübertragung mit virus-tragenden 
Schildläusen auf virusfrei getestete Pflanzen 
mit Hilfe der Clip-Käfig-Methode. 
 
 
Fig. 4.  Übertragung der Viren mit Hilfe von 
Schildläusen auf trocknenden Blättern virus-
positiver Pflanzen, die an virusfrei 
getesteten Pflanzen befestigt werden, so 
dass die Schildläuse überwandern können. 
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Der Virusnachweis in den vermeintlich infizierten Testpflanzen erfolgt nach 4-6 Monaten Inkubation 
des Virus. Ein zweiter Nachweis erfolgt in der Regel nach 10-12 Monaten. Routinemäßig erfolgt der 
Test mit Hilfe von ELISA, kann jedoch auch mit Hilfe von RT-PCR erfolgen, einer präziseren Methode 
mit der falsch-positive Befunde vermieden werden können. Von jeder Pflanze entnimmt man eine 
Probe von 3 vorzugsweise älteren Blättern, möglichst von verschiedenen Trieben. Alternativ kann man 
im Winterzustand auch das Holz beproben. Der Virusnachweis sollte zur kühlen Jahreszeit erfolgen, 
weil hohe Temperaturen die Vermehrung der Viren in der Pflanze unterbinden können. 
 
II. Natürliche Infektiosität von Schildläusen 
Voraussetzung für diese Art von Experiment sind: 
• Potentiell virustragende Schildläuse, die aus Weinbergen von Pflanzen mit nachgewiesenem 
Virusbefall entnommen wurden (d.h. natürliche Akquisition des Virus unter nicht 
kontrollierten Bedingungen). 
• Junge virusfrei getestete Testpflanzen (Stecklingsreben), die im geschlossenen Gewächshaus 
zur Inokulation mit Schildläusen produziert wurden. Wenn es sich bei den untersuchten Viren 
um einen Vitivirus (GVA, GVB, …) handelt, ist es möglich als Testpflanzen auch krautige 
Pflanzen, in denen sich das Virus vermehrt, zu verwenden. 
Die Schildläuse werden von den virustragenden Reben gesammelt, indem man ein oder mehrere mit 
Tieren besetzte Blätter und sie in verschlossenen Gefäßen ins Labor verbringt. Die Inokulations- sowie 
die Inkubationsphase erfolgt ebenso wie in Punkt I. beschrieben. 
 
Nachtrag: Allgemeine Vorsichtsmaßnahmen 
• Alle Versuchsmaterialien vor Versuchsbeginn zusammentragen (Pflanzen, Behältnisse, 
Präparationsbesteck, Stereomikroskop). 
• Laborkittel tragen. 
• Als Virusquelle dienende Pflanzen vor Versuchsbeginn identifizieren bzw. bereiten. Erst dann 
die Schildläuse sammeln. 
• Sich vergewissern, dass die Testpflanzen zu Anfang frei von Schildläusen sind. 
• Immer nur mit Schildläusen einer Art oder einer bestimmten Herkunft arbeiten, um 
Vermischungen zu vermeiden. 
• Stets unter vergleichbaren Bedingungen arbeiten, was Rebsorte, Temperatur, Tageslänge und 
Dauer von Akquisitions-, Inokulations-, Inkubationszeit anbelangt. 
 
Gérard HOMMAY und Etienne HERRBACH, INRA Colmar, 2018 
übersetzt von Christoph HOFFMANN, JKI Siebeldingen 
 
 
                                    
 


Experimente zur Übertragung von Rebenviren durch Schildläuse

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