UDP-glucuronosyltransferases (UGTs) are responsible for the metabolism of many xenobiotics, as well as several endogenous compounds like bilirubin and certain steroids. This thesis involves three major themes: UGT1A1 and Crigler-Najjar syndrome (CN); expression and characterisation of a novel UGT, UGT2A2; and the glucuronidation of various endogenous and synthetic steroids.
Fourteen different UGT1A1 mutations were identified in 19 CN patients, four of which were novel. The mutant proteins were expressed in baculovirus infected Sf9 insect cells and their activity towards bilirubin and other substrates was determined. Residual glucuronidation activity and the severity of hyperbilirubinemia were found to correlate well in most cases. In addition, a major advancement to aid the development of gene therapy for CN was achieved by in discovering that ezetimibe glucuronidation correlates with reduction of serum bilirubin in gene therapy treated Gunn rats. This compound might be useful in examining the efficacy of gene therapy in humans in the future.
When the novel UGT2A2 was cloned, expressed, and studied alongside UGTs 2A1 and 2A3, results indicated that UGT2A2 is a functional enzyme with broad substrate specificity. UGT2A2 was found to be expressed mainly in nasal mucosa, similar to UGT2A1. In addition, UGT2A1 and UGT2A2 were found to differ largely in their regioselectivity towards estrogens.
Lastly, the glucuronidation of estriol, 16-epiestriol, 17-epiestriol, 13-epiestradiol, ent-estradiol, ent-androsterone, and ent-etiocholanolone by different UGT enzymes was studied and analytical methods for analysing these compounds were developed. UGTs 1A10 and 2B7 were found to be the most active UGTs in the glucuronidation of almost every steroid studied. Several patterns in the regio- and stereoselectivity of steroid glucuronidation were observed for the first time. The effects of phenylalanines 93 and 90 on human UGT1A10 on glucuronidation were also studied, exploiting site directed mutagenesis. The results revealed that F93 is involved in the interactions of the enzyme with estrogens and a homology model of UGT1A10 was created based on the results.
Knowledge of glucuronidation of endogenous compounds is important, since it may be directly or indirectly linked to clinical conditions, like Crigler-Najjar syndrome, and also because certain drugs that inhibit UGTs, may inhibit the metabolic pathways of endogenous substrates that are metabolised by UGTs. Understanding the glucuronidation of steroids could be used to make better predictions on the role of glucuronidation in the metabolism of newly designed drugs that resemble steroids. Detailed information on steroid glucuronidation may also be used in determining UGT structure via function and the results obtained during this PhD work may also be used in the development of more detailed homology models of other UGT enzymes.Imeytymisen ja vaikuttamisen jälkeen lääkeaineet poistuvat elimistöstä tavalla tai toisella. Yleisin näistä poistumistavoista on metaboloituminen ja se tapahtuu yleensä maksassa. Metaboliassa lääkeainetta muutetaan kemiallisesti siten, että se on helpommin eritettävissä virtsaan tai sapen kautta ulosteeseen. UDP-glukuronosyylitransferaasit, eli UGT:t, ovat yksi metaboliaan osallistuvista entsyymiryhmistä. Ne katalysoivat glukuronidaatiota, eli glukuronihapon liittämistä eritettävään molekyyliin. Lääkeaineiden ja erilaisten myrkkyjen lisäksi UGT:t osallistuvat myös elimistön omien, sisäsyntyisten, molekyylien metaboloimiseen. Tämä väitöskirja keskittyykin pääasiassa näiden sisäsyntyisten molekyylien, kuten bilirubiinin ja steroidien, glukuronidaatioon.
Väitöskirjatyössä on tutkittu kolmea eri UGT entsyymeihin liittyvää aihepiiriä, joista ensimmäinen on UGT1A1 ja Crigler-Najjarin syndrooma. Crigler-Najjarin syndrooma on harvinainen perinnöllinen sairaus, joka johtuu mutaatioista UGT1A1 entsyymissä ja jota luonnehtii bilirubiinin kertyminen elimistöön ja vakava, hoitamattomana kuolemaan johtava, keltaisuus. Työssä tunnistettiin 14 erilaista Crigler-Najjarin syndroomaa aiheuttavaa mutaatiota UGT1A1 entsyymistä, ja näistä neljä oli aiemmin tuntemattomia. Kyseisten mutanttiproteiinien aktiivisuutta verrattiin normaaliin UGT1A1 entsyymiin, ja useimmissa tapauksissa mutanttiproteiinien aktiivisuuden havaittiin korreloivan hyvin taudin vakavuuden kanssa. Lisäksi väitöskirjatyössä edistyttiin geeniterapeuttisen hoidon kehittämisessä Crigler-Najjarin syndroomaan. Etsetimibin glukuronidaation havaittiin korreloivan veren bilirubiinipitoisuuden laskemisen kanssa geeniterapeuttisesti hoidetuilla rotilla. Tämä löytö saattaa olla hyödyllinen tulevaisuudessa, kun Crigler-Najjarin syndrooman geeniterapeuttista hoidon toimivuutta arvioidaan ihmispotilaissa.
Toiseksi väitöskirjatyössä karakterisoitiin aiemmin tuntematon UGT-entsyymi, UGT2A2. UGT2A2:n havaittiin esiintyvän lähinnä nenän limakalvolla ja sen todettiin kykenevän glukuronoimaan lukuisia erilaisia molekyylejä. Uuden UGT2A2 entsyymin karakterisoiminen on olennaista paitsi perustutkimukselle, myös nenän kautta annosteltavien lääkkeiden tutkimukselle.
Kolmanneksi väitöskirjatyössä tutkittiin eri UGT entsyymien aktiivisuutta steroidien glukuronidaatiossa. Tulosten perusteella pyrittiin tekemään päätelmiä UGT entsyymien aktiivisen kohdan rakenteesta ja eri UGT-entsyymien välisistä eroista. Tämän tiedon avulla voidaan tulevaisuudessa parantaa glukuronidaation ennustettavuutta lääkekehityksessä ja tuottaa hyödyllistä tietoa lääkeaineiden kehityksen ja turvallisuuden saralle
