Rotaviruksen VP6-antigeenin puhdistusmenetelmän kehitys

Abstract

Useiden tärkeiden in vitro -diagnostisten testien toimintaperiaate perustuu vasta-aineiden kykyyn tunnistaa kohdeantigeeni ja sitoutua siihen spesifisesti. Antigeenejä on mahdollista tuottaa korkealaatuisina rekombinanttiproteiineina, joita voidaan käyttää testi- ja kontrolliantigeeneinä lääketieteellisissä tutkimuksissa, diagnostiikassa ja diagnostisten testien laadunvalvonnassa. Rotavirus A on yleisin vauvojen ja pienten lasten vakavien ripulitautien aiheuttaja. Rotavirusinfektion rutiinidiagnostiikka perustuu rotavirusantigeenin havaitsemiseen potilasnäytteissä. Rotaviruksen kapsidin immunogeeninen rakenneproteiini, virusproteiini 6 (VP6), on hyvin konservoitunut eri rotavirus A -kantojen välillä, joten se sopii hyvin diagnostiseksi antigeeniksi. Työn tavoitteena oli kehittää rekombinanttisen VP6-antigeenin puhdistusmenetelmää. VP6-antigeeni tuotettiin Escherichia colissa (E. coli) fuusioproteiinina, jossa pieni ubikitiinin tyyppinen modifikaattori (Small Ubiquitin-Like Modifier, SUMO) oli liitetty VP6-proteiiniin. Tuotettu SUMO-VP6-fuusioproteiini puhdistettiin nikkeli(Ni)-affiniteettikromatografialla kahdessa eri vaiheessa. Ensimmäisessä vaiheessa SUMO-VP6-proteiini puhdistettiin lysaatista. Toisessa vaiheessa fuusioproteiinin SUMO-osa pilkottiin fuusioproteiinista entsymaattisesti, minkä jälkeen VP6-proteiini erotettiin irronneesta SUMO-osasta. Lopputuotteen immunoreaktiivisuus määritettiin fluoroimmunoanalyysillä (FIA) ja puhtaus natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE). Tulosten perusteella VP6-antigeenin tuottaminen SUMO-VP6-fuusioproteiinina toimi hyvin, mutta VP6-antigeenin puhdistaminen ei ollut täysin suoraviivaista. VP6-antigeenin luontainen taipumus muodostaa trimeerejä sekä suurempia proteiininkomplekseja hankaloitti puhdistusmenetelmän optimointia. SUMO-VP6-fuusioproteiinin havaittiin eluoituvan gradientin eri vaiheissa, mikä todennäköisesti aiheutui muodostuneiden SUMO-VP6-proteiinikompleksien sisältämien polyhistidiinihäntien erilaisista vuorovaikutuksista Ni-affiniteettipylvään kanssa. Epälineaarisen eluoitumisen vuoksi lopputuotteen saannon maksimoiminen puhtautta heikentämättä oli haastavaa: lopputuotteessa havaittiin epäpuhtauksia ja lopputuotteen immunoreaktiivisuus oli kontrolliin verrattuna selvästi heikompi