Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica), apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2012O patogéneo humano Staphylococcus aureus possui uma elevada capacidade de infeção graças às inúmeras estratégias de que dispõe para sobreviver no interior de células fagocitárias do sistema imunitário inato. Dentro do hospedeiro, S. aureus é sujeito a concentrações elevadas de espécies reativas de oxigénio (ERO) e de azoto (ERA) que danificam componentes celulares vitais para a sobrevivência da bactéria. Contudo S. aureus dispõe de várias proteínas que permitem eliminar estas espécies reativas e reparar os danos sofridos durante a exposição a estes compostos. A Ric (repair of iron centers) de S. aureus é uma das proteínas cujo gene tem uma expressão aumentada durante a exposição das células de S. aureus a peróxido de hidrogénio (H2O2) e óxido nítrico (NO). Em estudos bioquímicos, foi mostrado que esta proteína é capaz de reparar centros de ferro-enxofre oxidados ou nitrosilados. Neste estudo pretendeu-se estabelecer que sistemas de regulação controlam a expressão do gene ric em S. aureus. Um dos candidatos é o sistema de regulação SrrAB, que se encontra descrito como estando associado à expressão de genes induzidos por NO. Para investigar se SrrAB controla a expressão do gene ric tentou-se gerar uma estirpe de S. aureus mutada no operão srrAB. Para tal várias metodologias foram utilizadas, contudo a mutação não foi alcançada. O papel dos reguladores globais Fur e PerR, envolvidos na homeostase do ferro e nas respostas ao stress oxidativo, respetivamente, foi também avaliado. Para tal determinou-se, por ensaios semiquantitativos de RT-PCR, os níveis de transcrição do gene ric em mutantes de S. aureus Δfur e ΔperR. Deste modo, mostrou-se que em S. aureus os reguladores Fur e PerR controlam positivamente a transcrição do gene ric.Staphylococcus aureus is a Gram-positive coccus that can cause life-threatening diseases when invades de human body. Inside the host, this pathogen can easily evade the innate immune response thanks, in part, to is sophisticated systems which eliminate oxidative and nitrosative species and promote the repair of the damages inflicted. The S. aureus Ric (repair of iron centers) is one of the proteins whose gene is up-regulated when S. aureus cells are exposed to hydrogen peroxide (H2O2) and nitric oxide (NO). It has been shown that this protein as the ability to restore iron-sulfur clusters damaged by oxidation and nitrosylation. The goal of this study is to understand which transcription factors of S. aureus control the expression of ric gene. The two-component regulatory system SrrAB, which has been implicated in the control of genes induced by NO, is one of the regulators that may be involved in the ric expression. To address this question, the generation of a S. aureus strain with a silent srrAB operon was attempted through different methodologies. However, the successful mutation could not be achieved. The role of S. aureus Fur and PerR in ric expression was also investigated. These two proteins are well known transcription factors that control iron-homeostasis and inducible peroxide-defense genes, respectively. In this study, we performed RT-PCR semi-quantitative analyses of ric transcription in the S. aureus Δfur and ΔperR mutant strains and established that ric gene is positively controlled by both Fur and PerR
