The effect of copper and silver nanoparticles Cu+Ag, silver nitrite AgNO3 and zinc oxide ZnO on morphology and mechanical properties of immunocompetent cells bovine kidney line MDBK is investigated by atomic force microscopy. The results of calculation of the local elastic modulus, strength, surface cell adhesion, adhesion work, and the three-dimensional image analysis of cells in control and after incubation with the nanoparticles bioelements for 20 min are presented.Методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) исследовано влияние наночастиц меди и серебра Cu+Ag, нитрита серебра AgNO3 и оксида цинка ZnO на морфологию и механические свойства иммунокомпетентных клеток почки быка линии MDBK. Представлены результаты расчетов локального модуля упругости, силы поверхностной адгезии клеток, работы адгезии, а также анализа трехмерных изображений клеток в контроле и после инкубации с наночастицами биоэлементов в течение 20 мин

A. Mohammed Salem A.

E. Drozd S.

M. Mychko E.

N. Kuzhel S.

O. Spiridonova S.

S. Chizhik A.

А. Мохаммед Салем А.

Е. Дрозд С.

М. Мычко Е.

Н. Кужель С.

О. Спиридонова С.

С. Чижик А.

E. S. Drozd

A. A. Mohammed Salem

S. A. Chizhik

O. S. Spiridonova

N. S. Kuzhel

M. E. Mychko

Е. С. Дрозд

А. А. Мохаммед Салем

С. А. Чижик

О. С. Спиридонова

Н. С. Кужель

М. Е. Мычко

Proceedings of the National Academy of Sciences of Belarus, Physical-Technical Series / Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия физико-технических наук

97ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 4 2014СЕРЫЯ ФІЗІКА-ТЭХНІЧНЫХ НАВУКУДК 576.6:612.017.1:576.3Е. С. ДРОЗД1,2, МОХАММЕД САЛЕМ А. А.3, С. А. ЧИжИК1,  О. С. СПИРИДОнОВА1,4, н. С. КУжЕЛь1, М. Е. МыЧКО3ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДОМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ  ВЛИЯНИЯ НАНОЧАСТИЦ НА СТРУКТУРНЫЕ  И МЕХАНИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КЛЕТОК ПОЧКИ БЫКА ЛИНИИ MDBK1 Институт тепло- и массообмена им. А. В. Лыкова нАн Беларуси, 2 Генуэзский университет, 3 Белорусский национальный технический университет, 4 Минский городской клинический онкологический диспансер(Поступила в редакцию 28.08.2014)Введение. Особое место в современной биологии занимает изучение влияния наночастиц на клетки . Их широкое применение в медицине обусловлено уникальными антибактериальными свойствами . Наночастицы находят свое применение в борьбе против некоторых вирусов, для ле-чения ожогов, уничтожения опухолевых клеток, а также в качестве средств доставки лекар-ственных препаратов к больному органу . Известно, например, что наночастицы оксида цинка (ZnO) способны к ингибированию процесса репликации вирусов [1] . С одной стороны, примене-ние цинка в любой фазе вирусной репликации прекращает формирование нового вируса . С дру-гой, цинк обладает иммуно стимулирующим эффектом, при его небольших концентрациях функции иммунной системы восстанавливаются [2] . Он участвует в регуляции процессов акти-вации лимфоидных клеток, пролиферации и апоптоза . Таким образом, большой интерес пред-ставляет разработка современных препаратов на основе наночастиц с иммуно стимулирующим, антибактериальным и противовирусным эффектом . Для подобных разработок большое значение имеет учет влияния препаратов на основе наночастиц на различные бактерии и вирусы, а также на клетки иммунной системы . Цель данной работы - исследование методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) влияния наночастиц на культуру клеток почки быка линии MDBK (Madin-Darby Bovine Kidney Cells), а также определение модуля упругости и силы адгезии клеток почки быка при воздействии на них наночастиц меди и серебра (Cu + Ag), нитрита серебра (AgNO3) и ZnO . MDBK - культура эпителиальных клеток почки быка [3] . Она широко используется для изо-ляции вирусов диареи крупного рогатого скота, везикулярного стоматита (индийский штамм), инфекционного ринотрахеита и парвовируса крупного рогатого скота, аденовирусов I и III круп-ного рогатого скота, вируса парагриппа-3 [4] . Кроме того, эта культура является основной при получения культуральных противовирусных вакцин . Методы и материалы исследования. Для визуализации одиночных частиц использовали специальную методику подготовки образцов, которая заключалась в гидрофилизации подложки и последующем осаждении наночастиц из суспензии L-B-L-способом, т . е . в вертикальном осаж-дении частиц на подложку . Очищенную подложку выдерживали в коллоидном растворе наноча-стиц в течение 5-10 мин, промывали дистиллированной водой и высушивали на воздухе . Для осуществления гидрофилизации кремниевую подложку помещали в раствор, состоящий из 2 мл раствора аммиака, 2 мл пероксида водорода и 10 мл воды и выдерживали в течение 15 мин при 75 °С . Затем промывали дистиллированной водой и высушивали . Оценка качества подготовлен-ного образца наночастиц проводилась с помощью оптического микроскопа Микро200 (ОАО «Планар», Беларусь) . 98Для получения образцов клеток, пригодных для АСМ-исследования, применяли химическую фиксацию . С этой целью культуру клеток инкубировали в течение 20 мин с суспензией наночастиц, разведенной в соот-ношении 1:5 раствором Хэнкса . Клетки отмывали фос-фатным буфером, добавляли 1,5%-ный раствор глута-рового альдегида на 30 мин, дважды отмывали фосфат-ным буфером и дистиллированной водой и высушивали на воздухе при комнатной температуре . АСМ-исследования проводились с помощью прибо-ра НТ-206 (ОДО «Микротестмашины», Беларусь) в кон-тактном режиме . Использованы кремниевые зонды («MikroMasch» Co, Эстония) NSC11 радиусом 20 нм с константой жесткости консоли 3 Н/м .Влияние наночастиц на клеточную линию MDBK. На рис . 1, 2 представлены изображения топографии по-верхности клетки линии MDBK, полученные с помо-щью атомно-силового микроскопа . Размеры частиц се-ребра определяли по профилю сечения поверхности изображения подложки с наночастицами, получаемому после сканирования исследуемого образца . На профилях маркерами отмечали края каждой частицы . Оценка размера частиц методом АСМ показала, что на поверхности кле-ток он составляет 220–250 нм .Рис . 1 . АСМ-изображение топографии поверх-ности мембраны клеток линии MDBK (кон-трольные образцы, размер поля сканирования 7×7 мкм)Рис . 2 . Топография мембраны клетки с наночастицами Cu+Ag на поверх ности, область сканирования 8,1×6,4 мкм (а), 6,2×6,2 мкм (в) и профиль сечения наночастицы (б, г)99Влияние наночастиц биоэлементов на упругие характеристики клеток линии MDBK. С помощью атомно-силового микроскопа методом индентирования изучены упругие характери-стики клеток . На практике индентирование осуществляется в режиме статической силовой спек-троскопии . В результате устанавливается связь между силой и величиной деформации образца в области внедрения зонда . Расчет модуля упругости по формуле Герца [5] показал, что для кле-ток почки быка после 20 мин их инкубации с суспензией наночастиц характерны следующие значения модулей упругости E, МПа: контроль - 6,92±0,36; Cu+Ag - 8,09±0,45; AgNO3 - 9,56±0,68; ZnO - 0,017±0,001 . Значение модуля упругости клеток контрольного образца ниже, чем у клеток после воздействия наночастиц Cu+Ag и AgNO3 . После воздействия наночастиц ZnO модуль упругости клеток уменьшается . Таким образом, анализируя полученные результаты, можно отметить, что проникновение наночастиц Cu+Ag и AgNO3 внутрь клеток увеличивает их жесткость . Совершенно иное дей-ствие на клетки оказывают наночастицы ZnO, уменьшая упругость клеток более чем на порядок . Исходя из расчетов модуля упругости и анализа трехмерных изображений клеток после 20 мин инкубации с наночастицами ZnO, можно предположить, что в данном случае происходит силь-ное повреждение клеток .Влияние наночастиц на адгезионные свойства клеток линии MDBK. Удельная поверх-ностная энергия (работа адгезии) g определяется энергией, затраченной на разрыв связи по кон-такту между фазами и энергией, отнесенной к единице площади контакта . Удельную поверх-ностную энергию и силу адгезии соответственно вычисляли по формулам:  2,3aFRg =p   a deflF kZ=  .Здесь R – радиус закругления острия зонда, k – жесткость консоли; Zdefl – изгиб консоли по вер-тикали, рассчитываемый по кривым подвода-отвода, получаемым в статическом режиме АСМ .Результаты расчета силы адгезии и значения поверхностной энергии клеток линии MDBK представлены в таблице . Можно констати ровать, что воздействие наночастиц AgNO3 и ZnO при-водит к уменьшению силы адгезии и поверхностной энергии . Как было показано выше, при ин-кубировании клеток с наночастицами ZnO происходит значительное снижение модуля упруго-сти (примерно в 40 раз), кроме того, наблюдаются морфологические изменения клеток . Таким образом, наночастицы ZnO оказывают сильное повреждающее воздействие на клетки почек быка в отличие от наночастиц AgNO3, не проявивших токсического эффекта .Характеристики адгезии клеток MDBKОбразец Fа, нН g, Дж/м2Контроль 48,91±3,26 0,13±0,01AgNO3 41,95±3,89 0,11±0,01ZnO 36,80±6,71 0,09±0,01Влияние наночастиц на структурные особенности клеток линии MDBK. Для исследова-ния влияния наночастиц на клетки животных выбраны наночастицы AgNO3 и ZnO . Известно, что наночастицы производных серебра оказывают повреждающее действие на вирусы, а наноча-стицы ZnO не обладают антибактериальными свойствами . В качестве объекта для исследования влияния наночастиц AgNO3 и ZnO выбрана культура клеток линии MDBK . На рис . 3 представлены изображения отдельной клетки MDBK и участка по верхности мем-браны, полученные в режиме латеральных сил . Исследование топографии показало, что поверх-ность клеток MDBK гладкая и ровная, без явно выраженных структурных элементов . Результа-ты исследования топографии поверхности после инкубации с суспензией наночастиц AgNО3 при 37 °С представлены на рис . 4 . После взаимодействия клеток линии MDBK с наночастицами AgNO3 наблюдались измене-ния формы их поверхности по сравнению с контрольным образцом (поверх ность клеток стала 100более рельефной с ярко выраженными выступами округлой формы) . Топография поверхности клетки MDBK, подвергшейся влиянию наночастиц ZnO, приведена на рис . 5 .В результате взаимодействия клеток MDBK с наночастицами ZnO их форма сильно измени-лась по сравнению с формой клеток контрольного образца . Можно предположить, что в резуль-Рис . 3 . АСМ-изображение поверхности клеток MDBK: а – топография поверхности, область сканирования 8,5×8,5 мкм2; б – изображение в режиме латеральных сил, область сканирования 4,6×4,6 мкм2Рис . 4 . АСМ-изображение поверхности клеток MDBK после их инкубации с AgNO3; а – топография поверхности, об-ласть сканирования 7,2×7,2 мкм2; б –  изображение в режиме латеральных сил, область сканирования 3,1×3,1 мкм2Рис . 5 . АСМ-изображение поверхности клеток MDBK после их инкубации с наночастицами ZnO при 37 °С; а – топо-графия поверхности, область сканирования 6,7×6,7 мкм2; б – изображение в режиме латеральных сил,  область ска-нирования 3,1×3,1 мкм2 тате воздействия наночастиц ZnO происходит повреждение внутренней структуры клеток . Мор-фология поверхности также отличается от морфологии поверхности клеток, инкубированных с наночастицами AgNO3 . Наблюдается неоднородная поверхность клеток с ярко выраженными структурными образованиями . Заключение. Исследование влияния наночастиц на иммунокомпетентные клетки почки быка показало, что в результате инкубирования клеток с наночастицами меди и серебра, а так-же нитрита серебра значение модуля упругости увеличивается по сравнению с модулем упру-гости клеток контрольного образца . В случае инкубирования клеток с наночастицами оксида цинка наблюдается противоположный эффект – уменьшение величины модуля упругости кле-ток по сравнению с модулем упругости клеток контрольного образца . Установлено, что дей-ствие наночастиц оксида цинка приводит к значительному, практически разрушительному, из-менению формы и структуры поверхности клеток (возрастает шероховатость поверхности клет-ки) и к уменьшению силы адгезии на 30 % по сравнению с контролем . Литература1 . Burnham N. A. // J . Vac . Sci . Technol . 1989 . Vol . A7 . P . 1200–1210 .2 . Czajkowsky D. M. // J . of Electron Microscopy . 2000 . Vol . 49(3) . P . 395–406 .3 . Nagama M. // FEMS Microbiol . Lett . 1996 . Vol . 145 . P . 239–243 .4 . Генкель П. А. Микробиология с основами вирусологии: Учеб . пособие для студентов . биол . фак . пед . ин-та . М ., 1974 . 5 . Jacot J. G. // J . Biomed . Mater . Res . 2006 . Vol . A79 . P . 485–494 .E. S. DROZD, MOHAMMED SALEM A. A., S. A. CHIZHIK, O. S. SPIRIDONOVA, N. S. KUZHEL, M. E. MYCHKOa stuDy By atOMiC FOrCe MiCrOsCOPe OF eFFeCt OF nanOPartiCles On struCtural  anD MeChaniCal PrOPerties OF Cell lines MDBKsummaryThe effect of copper and silver nanoparticles Cu+Ag, silver nitrite AgNO3 and zinc oxide ZnO on morphology and mechanical properties of immunocompetent cells bovine kidney line MDBK is investigated by atomic force microscopy . The results of calculation of the local elastic modulus, strength, surface cell adhesion, adhesion work, and the three-dimensional image analysis of cells in control and after incubation with the nanoparticles bioelements for 20 min are presented .

Исследование методом атомно-силовой микроскопии влияния наночастиц на структурные и механические свойства клеток почки быка линии MDBK

https://vestift.belnauka.by/jour/article/download/77/78

Исследование методом атомно-силовой микроскопии влияния наночастиц на структурные и механические свойства клеток почки быка линии MDBK

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Proceedings of the National Academy of Sciences of Belarus, Physical-Technical Series / Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия физико-технических наук