The results of study the effect of temperature on the culture surface topography and mechanical properties of human lung cancer cell line A549 by atomic force microscopy are presented. It is shown that lowering the temperature of cultivation does not lead to significant changes in the mechanical properties of A549 cells, but the cells under the influence of low temperatures tend to increase the adhesive force between the probe tip to the membrane surface.Представлены результаты исследования методом атомно-силовой микроскопии влияния температуры культивирования на топографию поверхности и механические свойства раковых клеток легких человека линии А549. Показано, что понижение температуры культивирования не приводит к достоверным изменениям механических свойств данных клеток, однако увеличивает силу адгезии острия зонда к поверхности мембраны

A. Mohammed Salem A.

E. Drozd S.

N. Kuzhel S.

O. Spiridonova S.

S. Chizhik A.

А. Мохаммед Салем А.

Е. Дрозд С.

Н. Кужель С.

О. Спиридонова С.

С. Чижик А.

E. S. Drozd

A. A. Mohammed Salem

O. S. Spiridonova

N. S. Kuzhel

S. A. Chizhik

Е. С. Дрозд

А. А. Мохаммед Салем

О. С. Спиридонова

Н. С. Кужель

С. А. Чижик

Proceedings of the National Academy of Sciences of Belarus, Physical-Technical Series / Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия физико-технических наук

93ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 4 2014СЕРЫЯ ФІЗІКА-ТЭХНІЧНЫХ НАВУКРАДИОЭЛЕКТРОНИКА И ПРИБОРОСТРОЕНИЕУДК 612.117:57.08Е. С. ДРОЗД1,3, МОХАММЕД  САЛЕМ А. А.2, О. С. СПИРИДОнОВА1,  н. С. КУжЕЛь 1, С. А. ЧИжИК 1ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ТЕМПЕРАТУРЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ  НА МОРФОЛОГИЮ, МЕХАНИЧЕСКИЕ И АДГЕЗИОННЫЕ СВОЙСТВА  РАКОВЫХ КЛЕТОК ЛЕГКИХ ЧЕЛОВЕКА ЛИНИИ А549 1 Институт тепло- и массообмена им. А. В. Лыкова нАн Беларуси, 2 Белорусский национальный технический университет, 3 Генуэзский университет(Поступила в редакцию 28.08.2014)Введение. В настоящее время активно проводятся исследования механических свойств от-дельных клеток, в частности, модуля упругости [1-6] . Показано, что данный параметр является весьма информативным с точки зрения выявления ряда патологических состояний клеток [7] . В этой связи представляют значительный практический интерес разносторонние исследо вания влияния различных факторов на отдельные клетки, а также разра ботка методов оценки их эла-стических и адгезионных свойств как в норме, так и при определенных патологиях или внешних воздействиях (в том числе при взаимодействии с нанообъектами различной природы) .Представляется важным исследование влияния различных физических факторов на ряд важ-ных характеристик клеток, таких как дифференци ровка, пролиферация, клеточная гибель, ста-рение, иммортализация и раковая трансформация . Одним из таких факторов является темпера-тура . Интерес к данному фактору связан с исследованиями в области клеточных технологий, в которых для прекращения делений клеток и индуцирования дифференцировки предваритель-но выращенные при 37 °С клеточные культуры переносили в термостат с пониженной темпера-турой (30 °С) . Этот методический подход основан на работе [8], продемонстриро вавшей диффе-ренцировку стволовых клеток тератокарциномы мыши при 31 °С . Культивирование клеток при пониженной температуре применяется также в производстве рекомбинантных белков [9] . Цель настоящей работы - визуализация и количественная оценка в статическом режиме атомно-силовой микроскопии (АСМ) морфологичес ких неоднородностей, механических и адге-зионных свойств клеток рака легких человека линии А549, культивирован ных при разных тем-пературах .Материалы и методы исследования. Использованы культивируемые in vitro клетки рака легких человека (линия А549) . Их снимали с ростовой поверхности культурального сосуда с по-мощью трипсина и суспендировали в среде Игла с добавлением 10%-ной сыворотки эмбрионов телят и антибиотиков пенициллина и стрептомицина . Концентрацию клеток подсчитывали под микроскопом в камере Горяева .Клеточную суспензию А549 разбавляли средой так, чтобы при внесении в культуральный сосуд приходилось 5000 клеток на 1 см2 ростовой поверхности . Клетки вносили в культураль-ные сосуды с вложенными предметными стеклами, добавляли углекислый газ (5% CO2) и куль-тивировали трое суток при 37 °С в герметично закупоренных резиновыми пробками культу-94ральных сосудах . Через трое суток большинство клеток распластывалось на поверхности пред-метных стекол . Затем часть стекол (для исследования методом АСМ) с клетками линии А549 фикси ровали в восходящих концентрациях этанола (24, 48 и 96%, по 1 мин в каждой из концен-траций) и высушивали на воздухе . Остальные культуры линии А549 переносили в термостат при пониженной температуре (30 °С) и культивировали в течение дополнительных 11 сут . После 5 и 11 сут культивирования при 30 °С выполняли цифровое фотографирование клеточных куль-тур, а на 11-е сутки клетки на вложенных стеклах фиксировали этанолом . Исследование клеток методом АСМ осуществлялось при помощи специального эксперимен-тального комплекса, совмещающего функции сканирующей зондовой и оптической микроско-пии, с использованием стандартных кремниевых зондов NSC11 («MikroMasch») с константой жесткости консоли 3 Н/м . Комплекс состоит из атомно-силового микроскопа NT-206 (ОДО «Ми-кротестмашины», Беларусь) и оптической системы (BelOMO «ЛЭМТ», Беларусь) . Последняя по-зволяет позиционировать острие иглы на определенной области исследуемого образца . Результаты исследований. Компьютерные микрофотографии клеток линии А549 после 3-суточного культивирования при 37 °С (контрольный вариант), а также после дальнейшего культивирования при 30 °С представлены на рис . 1-4 . Через 5 сут культивирования клеток рака легких человека линии А549 при пониженной температуре отмечено появление соединенных друг с другом морфологически сходных клеток, образовавшихся в результате незавершенного митоза (рис . 2) . После 11-суточного культивирования при 30 °С регистрировали появление кле-ток с множественными выростами цитоплазмы (рис . 2), что свидетельствует об усилении дифференциро вочных процессов, а также наблюдали в большей части ростовой поверхности значительную гибель клеток . Поэтому препараты после фиксации этанолом было затруднитель-но применять для АСМ в связи с ограниченными возможностями поиска подходящих клеток в Рис . 1 . Оптическое изображение живых (а) и фиксированных (б) клеток линии А549 после 3 сут культивирования при 37 оСРис . 2 . Оптическое изображение клеток линии А549: а – после 3 сут культивирования при 37 оС и 5 сут культиви-рования при 30 оС (в центре – две сходные сестринские клетки, образовавшиеся в результате незавершенного ми-тоза), б – после 3 сут культивирования при 37оС и 11 сут при 30 оС (появляются клетки с множественными псевдо-подиями)95 используемой установке . По этой причине АСМ выполне-на только для контрольного варианта и варианта культи-вирования в течение 8 сут при 30 °С . Таким образом, для изучения параметров клеток с использованием метода контактно-зондовой микроскопии целесообразно приме-нять более высокую плотность посева клеток (например, 30000 клеток на 1 см2) либо уменьшать срок культивиро-вания при пониженной температуре .Под влиянием фиксации происходит конденсация кле-ток – они становятся компактнее (рис . 1) . В то же время на фиксиро ванных препаратах можно наблюдать изменения морфологии клеток при их культивировании в условиях пониженной температуры (рис . 1, б, 3) .С помощью оптической микроскопии обнаружены клетки с длинными выростами цитоплазмы, а также рас-пластанные клетки с увеличенной площадью при пониженной температуре . На фиксированных стеклах также наблюдали клетки с множественными псевдоподиями . Это свидетельствует о том, что под влиянием пониженной температуры происходят процессы дифференцировки кле-ток, а также, по-видимому, клеточного старения .Исследование топографии поверхности и модуля упругости образцов проводилось методом АСМ в контактном режиме сканирования стандартным кремниевым зондом NSC11 (жесткость консоли зонда k = 3 Н/м), радиус закругления которого составлял порядка 50 нм . На рис . 4, а представлены изображения топографии поверхности контрольного образца клеток .Далее проводилась оценка структуры поверхности клеток после 8 сут экспонирования при пониженной температуре (30 °С) (рис . 4, б) . Средние значения модуля упругости для клеток линии А549 на глубине внедрения 20 нм со-ставляют (2,01±0,07) МПа, при этом у данных клеток спустя 8 сут культивирования при пони-женной температуре модуль упругости составляет (1,98±0,11) МПа . Следовательно, значитель-ных изменений в эластичности клеток не обнаружено .Проведена оценка адгезии контрольного образца клеток линии А549 и клеток после 8 сут культивирования при пониженной температуре (30˚С) методом АСМ, который позволяет изме-рять силы, возникающие между острием зонда и исследуемой поверхностью . Для этого исполь-зуются зависимости перемещения от изгиба консоли (кривые подвода-отвода), получаемые при проведении процедуры статической силовой спектроскопии . Рис . 3 . Оптическое изображение клеток ли-нии А549 после 3 сут культивирования при 37 оС и 8 сут культивирования при 30 оС (фотография фиксированных клеток)Рис . 4 . АСМ-изображение клетки линии А549 (размер поля сканирования 14х14 мкм2): а – контрольный образец, б – образец, культивированный при пониженной температуре 30 °Са бПроцедура оценки силы адгезии выполнялась зондом NSC11, радиус закругления зонда 50 нм . Расчет контактной силы адгезии проводили по формуле a backF kZ=   где Fа – сила адгезии, Zback – изгиб консоли зонда при отрыве острия от образца, нм .Исследования показали, что сила адгезии контрольного образца составила (14,12±0,91) и (15,97±1,41) нН для клеток после 8 сут культивирования при пониженной температуре (30 °С) . Следовательно, у клеток под влиянием пониженных температур наблюдается тенденция к уве-личению силы адгезии острия зонда к поверхности мембраны .Заключение. По сравнению с культурой клеток линии А549, выращенной при 37 °С, после-дующее их экспонирование при пониженной температуре (30 °С) в течение 5 и 8 сут приводит к появлению клеток с удлиненными цитоплазматическими выростами . При пониженной темпе-ратуре отмечается также появление соединенных друг с другом морфологически сходных кле-ток, образовавших ся в резуль тате незавершенного митоза . В результате 11-суточного культиви-рования клеток линии А549 при 30 °С появляются клетки с множественными псевдоподиями, что свидетельствует об индуцировании процессов дифферен цировки . Также наблюдается значи-тельная гибель клеток . Исследование клеток линии А549 рака легких человека с помощью АСМ при культивировании клеток при 30 °С в течение 8 сут показало, что понижение температуры процесса не приводит к достоверным изменениям механических свойств данных клеток . Кроме того, можно утверждать, что у клеток под влиянием пониженных температур наблюдается тен-денция к увеличению силы адгезии поверхности мембраны к острию зонда .Литература1 . Sen Sh., Subramanian Sh., Discher D. E. // Biophysical J . 2005 . Vol .89 . P . 3203–3213 .2 . Wagh A. A., Roan E., Chapman K. E. et al . // Am . J . Physiol . Lung Cell Mol . Psiol . 2008 . Vol . 295 . P . L54–L60 .3 . Mustata M., Ritchie K., McNally H. A. // J . of Neoroscience Methods . 2010 . Vol . 186, issue 1 . P . 35–41 .4 . Maciaszek J. L., Andemariam B., Lykotrafitis G. // J . Strain Analysis . 2011 . Vol . 46 . P . 368–379 .5 . Kiss R., Bock H., Pells S. et al . // J . of Biomechanics Engineering . 2011 . Vol .133 . P . 1–9 .6 . Cross S. E., Jin Yu-Sh., Tondre J. et al . // Nanotechnology . 2008 . Vol .19 . P . 384003–384011 .7 . Lee G. Y. H., Lim C. T. // Biomechanics approaches to studying human diseases, Trends Biotechnol . 2007 . Vol . 25 . P . 111–118 .8 . Cremisi C., Duprey P. // J . Cell Physiol . 1986 . Vol . 129 . P . 230–236 .9 . Kumar N., Gammell P., Meleady P. et al . // BMC Biotechnol . 2008 . Vol . 8 . P . 42 .E. S. DROZD, MOHAMMED SALEM A. А., O. S. SPIRIDONOVA, N. S. KUZHEL, S. A. CHIZHIK inVestigatiOn OF CultiVatiOn teMPerature eFFeCt On surFaCe tOPOgraPhy  anD MeChaniCal PrOPerties OF А huMan lung CanCer Cell line a549summaryThe results of study the effect of temperature on the culture surface topography and mechanical properties of human lung cancer cell line A549 by atomic force microscopy are presented . It is shown that lowering the temperature of cultivation does not lead to significant changes in the mechanical properties of A549 cells, but the cells under the influence of low temperatures tend to increase the adhesive force between the probe tip to the membrane surface .

Исследование влияния температуры культивирования на морфологию, механические и адгезионные свойства раковых клеток легких человека линии А549

https://vestift.belnauka.by/jour/article/download/76/77

Исследование влияния температуры культивирования на морфологию, механические и адгезионные свойства раковых клеток легких человека линии А549

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Proceedings of the National Academy of Sciences of Belarus, Physical-Technical Series / Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия физико-технических наук