O'Connor, Brendan

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The image cannot be displayed. Your computer may not have enough memory to open the image, or The image cannot be displayed. Your computer may not have enough Desenvolvimento de fases de afinidade  para a separação de glicoproteína e análise  Dr. Brendan O’Connor  Escola de Biotecnologia Universidade de Dublin cidade, Irlanda Brasil  May 2013 The image cannot be displayed. Your computer may not have enough memory to open the image, or The image cannot be displayed. Your computer may not have enough  Dr. Brendan O’Connor Biotechnology & Protein Biochemistry  Dr. Dermot Walls Biotechnology & Virology ?  Dr. John Gallagher Chemical Sciences & Crystallography ?  The image cannot be displayed. Your computer may not have enough memory to open the image, or The image cannot be displayed. Your computer may not have enough Equipe multidisciplina para promover colaboração entre universidades brasileiras e irlandeses ;  •  a colaboração na investigação!•  intercâmbio de estudantes!•  intercâmbio de pessoal docente!•  3 ou 6 meses!•  1, 2, 3 anos  	  	  Bio-­‐Farmacologia	  	  	  ‘Ao	  longo	  dos	  próximos	  cinco	  anos,	  sete	  dos	  dez	  medicamentos	  comercializados	  em	  todo	  o	  mundo	  será	  biológicos’	  Randall	  Hyer,	  Global	  Head,	  Sandoz	  	  Agosto	  2012	  	  Estes	  agentes	  biológicos	  são	  principalmente	  glicoproteínas	  	  	  Farmacologia	  na	  Irlanda	   13 de 15 mundos	  principais	  empresas	  farmacêuticas    Representa	  52% exportações	  mechandise	  da	  Irlanda (2012)   Prioridade	  número	  1	  Nacional  Prioridade	  para	  Educação	  e	  pesquisa 	  	  	  	  	  	  Bio-­‐farmacologia	  na	  Irlanda	  	   	   	   	  Johnson	  &	  Johnson	  Eli	  Lilly	  Merck,	  Sharp	  and	  Dohme	  Pﬁzer-­‐Wyeth	  Schering-­‐Plough	  Bristol-­‐Myers-­‐Squibb	  Amgen	  Allergan	  Glaxo	  Smith	  Kline	  Aventis	  ,	  Novartis	  	  	  Farmacologia	  na	  Brasil	  No	  Brasil,	  o	  governo	  está	  apoiando	  duas	  empresas	  recém-­‐criadas,	  a	  Bionovis	  (Aché,	  EMS,	  Hypermarcas	  e	  União	  Química)	  e	  Orygen	  (Biolab,	  Eurofarma,	  Cristália	  e	  Libbs),	  querendo	  ser	  as	  primeiras	  empresas	  nacionais	  a	  desenvolver	  biossimilares.	  	  	  	  Farmacologia	  na	  Irlanda	   A	  Irlanda	  é	  um	  dos	  maiores	  exportadores	  de	  produtos	  farmacêuticos	  em	  todo	  o	  mundo	   Employent	  alta	  qualidade	   50% dos	  funcionários	  são	  graduados	   30% dos	  funcionários	  são	  licenciados	  em	  ciências  Indigenous Multinational Biotecnologia - indústria Certificate Diploma Post Grad Degree Athlone!Dublin!Newry!Belfast!Carlow!Cork!Waterford!Tralee!Limerick!Galway!Sligo!Letterkenny!Coleraine!Dundalk!Maynooth!Biotecnologia - academia    Biotecnologia em Irlanda 	  	  	  	  	  Produtos	  bio-­‐farmacologia	  Produzido na Irlanda Johnson & Johnson Procrit®  Remicade® Pfizer Viagra® Schering-Plough Intron A® Amgen Neupogen® Biogen Avonex® Genentech Rituxan® Wyeth  / Amgen Enbrel® Wyeth Prevenar® Eli Lilly Humulin R® Allergan Botox® Genzyme Renagel®   Indústria bio-farmacêutica!muitas novas terapêuticas são glico-proteínas!!"  Diagnósticos médicos!muitas alterações precoces do câncer são glico relacionado!"""  Ferramentas de investigação!!significado biológico da glico-proteína é de grande importância para a pesquisa básica!N-ligados manose       Galactose       Glicanos complexos   Diversidade estrutural e biológica	    Glicosilação - adição de açúcares!  N-ligados e O-ligados açúcares Necessita	  de	  ser	  capaz	  de	  separá-­‐las   Glico-formas  - difícil separar P.A.G.E. Análise v I.E.F. Análise! Glico-formas –  •  Força terapêutica diferente!•  Diferente semi-vida!•  Antigenicidade diferente Glico-formas - problema para a indústria !! Lectina 6!Lectina 5!Lectina 1!Lectina 2!Lectina 3!Lectina 4!análise bio!  Lectinas - proteínas que se ligam glicanos!"  Usado para criar superfícies de afinidade para Glico-proteína de separação e análise!Cloning em Escherichia coli ……  Clonado e expressa Lectinas Expressa	  e	  puriﬁcar	  lec;nas	  	  	   RPL-Gal1N RPL-Gal1C Yield = 150 mg L-1 Yield = 100 mg L-1 IMAC    Clonado e expressa Lectinas Clonado e expressa Lectinas"  Clone	  ,	  expressa	  e	  puriﬁcar	  lectinas	    fontes	  microbianas	  	  66.4	  kDa	  	  55.6	  kDa	  	  42.7	  kDa	  	  34.6	  kDa	  	  	  27.0	  kDa	  	  	  20.0	  kDa	  	  	  	  14.3	  kDa	  	  !	  66.4	  kDa	  55.6	  kDa	  42.7	  kDa	  	  34.6	  kDa	  	  	  27.0	  kDa	  	  	  20.0	  kDa	  	  	  	  14.3	  kDa	  	  !	  66.4	  kDa	  55.6	  kDa	  	  42.7	  kDa	  	  34.6	  kDa	  	  	  27.0	  kDa	  	  	  20.0	  kDa	  	  	  	  14.3	  kDa	  	  !Lec;n	  X!Lec;n	  YLec;n	  Z!Roisin Thompson, Ruth Larragy, Damian Keogh, Brendan O’Connor, Michael O’Connell and Paul Clarke. ‘Exploring the specificity determinants !of the Pseudomonas aeruginosa PA-IL lectin through site specific mutagenesis’.  (2013) Biochem. Biophys. Acta , In Press! !Damian Keogh,,Ruth Larragy, Ken McMahon, Michael O’Connell, Brendan O’Connor, Roisin Thompson and Paul Clarke.!‘Generating Novel Recombinant Prokaryotic Lectins with Altered Carbohydrate Binding Specificities and Affinities through Mutagenesis of the !PA-IL Protein from Pseudomonas aeruginosa’.  (2013) Biochemistry J , Submitted!Produção	  da	  biblioteca	  de	  lec;nas "  Clone	  ,	  expressa	  e	  puriﬁcar	  lectinas	     Glicano	  de	  ligação	  para.......Manose, Fucose, GlcNAc ,GalNAc e Sialyic acid    Clonado	  em	  E. Coli os	  sistemas	  de	  expressão	    Expansão	  da	  biblioteca	  lectina	  -­‐	  mutagénese	  dirigida	  	  	  	  	  	  	  aﬁnidades	  e	  especiﬁcidades	  alteradas 	  Lectina-X – se liga GlcNAc 	   mutagénese	  dirigida	  -­‐	  aﬁnidades	  alteradas !Roisin Thompson, Aileen Creavin, Michael O’Connell, Brendan O’Connor, Paul Clarke!‘Optimisation of the enzyme-linked lectin assay for enhanced glycoprotein and glycoconjugate analysis’. !(2011) Analytical Biochemistry , 413 , 2, 114-122.!!0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 TBST WT 1C8 1C11 2B12 2E 12 GSLII OD @ 450nm GafD 1-178 mutagenesis PBS Asialo Agalacto Fetuin Invertase BSA-GlcNAc 012345670 2 4 6 8 10 12Concentration PNP-GlcNAc (mM)VChbMutant AMutant BMutant ABMutant CMutant DCommercial Chb Mutagénese dirigida de uma enzima!!      a)! b)!00.20.40.60.811.2545 551 545/551 GSLIIAbsorbance 450nmBSA-GlcNAcAS AG Fetuina)! b)!ligação retida! atividade catalizador abolida!Enzima!	  	  	  	  	  	  	  	  Toxinas	  bacterianas	  –	  Cry	  	    Clonado toxinas Cry!  liga-­‐se	  a	  GalNAc & Tn antigen!  domínio	  de	  ligação	  apenas!	  Imobilização	  das	  lec;nas	  	  	  	  	   Combinação	  de	  ;	  tecnologia	  de	  ADN	  recombinante	  	   	   	  	  	  	  imobilização	  química	  VOS3	 VOS4	 VOS12	6x Cysteine 	6x Histidine	Lectina	6x Lysine 	1 Cysteine	Monólitos	  de	  carbono	  polímero polímeros	  polyHIPE contas	  separose	  colunas	  monoPLOT colunas capilares nanopartículas	  de	  Ouro nanopartículas	  de	  Sílica Purificada!Lectinas !recombinantes         Plataformas analíticas e separação!Enzyme Linked Lectin Assays ELLA  “Lectin Fingerprint” Thompson, R., Creavin, A., O’Connell, M., O’Connor, B. & Clarke, P. (2011). Analytical Biochemistry 413: 114-122.   Lectins - used for affinity based separation & selective purification of glycoprotein glycoforms (Lectin Affinity Chromatography).    Lectins can be used for glycoprotein analysis.!Lectins – Glycoanalytical Tools Nanopartículas de Ouro  (AuNP) •  microesferas de ouro feita em centro de pesquisa DCU!•  muito bom para a imobilização de proteínas!!             Lectinas!      !Enzimas!!Antocorpos!!+! +!Lectinas imobilizada em nanopartículas de ouro em monólitos Hassan Alwael , Damian Connolly , Paul Clarke , Roisin Thompson, Brendan O'Connor  and Brett Paull.!‘Pipette-tip selective extraction of glycoproteins with lectin modified gold nano-particles on a polymer !monolithic phase’. (2011) The Analyst , 136 , 2619-2628.!!Lectinas imobilizada em nanopartículas de ouro em monólitos Extracção de glicoproteínas de amostras ‘reais’ Galactosylated Glycoproteins from E. coli Lysate monólito rotação coluna & !disco sim!Lectinas imobilizada em nanopartículas de ouro em monóPLOTS   AuNP monoPLOT    monoPLOT Damian Connolly , Vincent O’Shea , Paul Clarke , Brendan O’Connor  and Brett Paull. !‘Evaluation of Photografted Charged Sites Within Polymer Monoliths in Capillary Columns !using Contactless Conductivity Detection’.  (2007) Journal of Separation Science , 30 , 17 , 3060-3068. !Lectina!  separação de glicoproteínas afins!  liberar por gradiente sem açúcar!    monoPLOT – AuNP - Lectina Lectinas imobilizada em nanopartículas de ouro em monóPLOTS                                 •  multi-lectinas de separação por afinidade da terapêutica glicoproteína Lectina monoplot fichas mircofluidic Lec;nas	  imobilizada	  em	  nanoparOculas	  de	  silica 1   amostra de teste!2   não ligado!3   eluição com açúcar livre 1        2     3 RN AT Fluorescência lectinas marcadas imobilizada em sílica !nano-partículas!Lectina imobilizada em polyHIPES   HIPE: High Internal Phase Emulsion a estrutura de células abertas ;!•  Macropores: > 50 nm  •  Mesopores:  2 nm - 50 nm •  Micropores: < 2 nm    área de superfície elevada    baixo custo monômeros!fase aquosa!Emulsão de alta fase interna!	  Lec;na	  imobilizada	  em	  polyHIPES 	  eGFP = fusão GFP lectina (fluorescente) imobilizar!eGFPPolyHIPE HNNH2OCOONanPolyHIPE HNNHOCOONaNH2ONHOx yeGFPjellyfish polyHIPE !Lectina imobilizada em polyHIPES  Lec;na	  imobilizada	  em	  polyHIPES ← Phipe-eGFP2 and Phipe-eGFP1→ (zoom *10) (zoom *4) (zoom *10) ← Ref. pHIPE-g-PGA → ‘Polypeptide grafted macroporous PolyHIPE by surface initiated N-Carboxyanhydride Polymerization as a platform for bioconjugation’. Fabrice Audouin, Mary Fox, Ruth Larragy, Brendan O’Connor and Andreas Heise  (2012) Macromolecules,  45, 6127-6135.  !!Protein immobilization onto poly(acrylic acid) functional macroporous PolyHIPE via surface initiated ARGET ATRP from multi-tasking amino-polyHIPE precursor. Fabrice Audouin, Ruth Larragy, Mary Fox, Brendan O’Connor, Andreas Heise (2012) Biomacromolecules , 13, 11, 3787-3794.!!	  	  	  fundido	  com	  	  GFP	  fundido	  com	  DsRed	  66.4	  kDa	  55.6	  kDa	  42.7	  kDa	  34.6	  kDa	  27	  kDa	  20	  kDa	  	  	  	  1	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  2	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  3	  	  	  	  	  	  	  	  	  4	  	  	  	  	  	    Imobilizado	  eGFP	  SiaA	    Coluna	  polyHIPE	  	    separação	  de	  fetuina	  e	  asialo-­‐fetuina	    apenas	  uma	  diferença	  de	  açúcar	  entre	  proteínas	  !!	    glycoforms	  estreitamente	  relacionados	  	  Diagnós;co	  -­‐	  rotulagem	  lec;na	  de	  células em	  colaboração	  com	  	  Dermot Walls •  Microﬂuídica	  •  Células	  capturados	  pela	  gravidade	  •  Roca	  por	  difusão	  •  lectinas	  marcadas	  •  Padrões	  de	  glicosilação	  	  	  alterada	  no	  cancro	  ‘Lab-in-a-trench’ (LiaT) Obrigado !!com desculpas para o meu terrível brasileira! "I Coloquio de tecnologia entre Brasil e Irlanda (2012)  1 • Obrigado por nossa ótima introdução para ...Caipirinhas !!  File patent & protect IP   Establish Large Scale RPL production in two 5 Litre Stir Tank Bioreactors    Produce consistent batches of purified RPL protein for immobilisation onto affinity columns   Validate the RPL -sepharose columns for consistent robust Glycoprotein separations   Engage with instrument providers ""!Commercialisation Activities Glycoseparation Solutions For The Life Science Industries (Funded by Enterprise Ireland Commercialisation Fund) Project lead by Paul Clarke & Roisin Thompson Cyanogen Bromide Activated Sepharose !LECTIN! LECTIN! LECTIN!Epoxy!  Immobilization using well established chemistries.   Exploits intrinsic protein amino acid residues – Lysines, Cysteines, StrepII.   Commercially available derivatised resins. Affinity Chromatography ; RPL Lectin-Sepharose Resins ECL   " RPL-Gal2  Binding Capacity Experiments    RPL-Gal Sepharose Resins & FPLC Columns Affinity Chromatography ; RPL Lectin-Sepharose Resins •  Red	  circle	  LCA	  lectin	  •  Blue	  circle	  ECL	  lectin	  •  Removes	  potential	  interference	  between	  lectins	  for	  multicolour	  imaging	  Diagnostics ; Sequential Lectin labelling             Single Live Cell Glycoprofiling	  

Glycoprotein separation and analysis

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