・BMMCにおいてLPS刺激で, mRNAレベルでのIL-9が発現していることがわかった。・BMMCにおいてLPS刺激で, タンパクレベルでのIL-9が発現していることがわかった。・BMMCにおいてIL-9はmRNAレベルでもタンパクレベルでもLPS濃度依存的に発現していることがわかった。・BMMCにおいてIL-9の産生にはIL-3が必須であることがわかった

Teruo Ikeda

池田 輝雄

・BMMCにおいてLPS刺激で, mRNAレベルでのIL-9が発現していることがわかった。
・BMMCにおいてLPS刺激で, タンパクレベルでのIL-9が発現していることがわかった。
・BMMCにおいてIL-9はmRNAレベルでもタンパクレベルでもLPS濃度依存的に発現していることがわかった。
・BMMCにおいてIL-9の産生にはIL-3が必須であることがわかった。P(論文)40016759572特集application/pdfFEATURE ARTICLESdepartmental bulletin pape

池田, 輝雄

Ikeda, Teruo

Azabu University Science Information Repository / 麻布大学学術情報リポジトリ

研究科分 麻布大学雑誌　第17・18巻・2008年細菌抗原に対する免疫担当細胞の機能解析F朋。∫’oηαZoηα1y5θ∫（～プ〃ηη観z8c6〃M8α∫η3酌oc’θr’1αα癬8α∬池田輝雄麻布大学獣医免疫学研究室Teruo　IKEDALaboratory　of　Veterinarian　Immunology，　Azabu　University（背景と目的）　近年，自然免疫および適応免疫におけるマスト細胞の機能が注目されている。我々はマスト細胞の免疫担当細胞としての機能に注目し感染局所においては，マスト細胞の増殖因子として知られるIL－9がマウス骨髄由来培養マスト細胞（BMMC）に対してLPS刺激によりIL－9　mRNAの発現を強く誘導することを見出した。また，IL－9はBMMCの細胞増殖を単独では誘導しないが，IL－3およびSCFとの共培養で相加的に促進させることを示し，LPS存在下でのIL－9産生によるマスト細胞のオートクライン増殖の可能性を示唆し，グラム陰性菌感染局所でのマスト細胞の役割を考察した。そこで今年度は，LPS刺激によるBMMCからのIL－9の産生をELISAを用いてタンパクレベルで検討し，IL－9産生によるオートクラインの検証を試みた。（材料と方法）マスト細胞の培養　マスト細胞はBALB／cマウスから調整した骨髄由来培養マスト細胞bone　marrow　drived　mast　cells（BMMCs）を用いた。LPSでの刺激　α・mediumにIL－3（2　ng／ml）とSCF（10　ng／ml）を添加した培地にBMMCs　lx106個月mlを100μ1プレートにまき，E∫c11εrfc1加col∫B4：0H1由来のLPS（Sigma）でそれぞれ実験により時間（12h24　h　48　h），濃度（10ng／ml　100　ng／ml　lOOO　ng／ml）を変化させ刺激した。サイトカインの定量　刺激したサンプルの上清をサンドイッチELISA法を用いて測定した。本法は下記に示した。リアルタイムPCR　マスト細胞からのTotal　RNAの調整は，　ISOGEN（ニッポンジーン）を使用した。cDNAの合成はSUPERSCRIPT　H　RT（lnvitrogen）を用いた。　サイトカインのmRNA発現レベルは，　AppliedBiosystems　7300　real．time　pCR　systemを用いて，TaqManアッセイおよびSYBR　Greenアッセイで測定した。サイトカインのRNA発現はGAPDHに対するRNA発現値として示した。サンドイッチELISAによるIL－9の定量　IL－9を測定するためにサンドイッチELISA法を用いた。方法はU字マイクロプレート（greiner社製）細菌抗原に対する免疫担当細胞の機能解析 113にCapture抗体（PEPROTECH社の500－P5g）をCoating　Buffer　pH95（BD社）で1mg／mlに調整し，100ml／wellずつ入れ，4℃でovernightして固相化した。PBS－tween－20で洗浄後，1％BSAのPBSで1時間室温でブロッキングし，洗浄後，スタンダードあるいはサンプルを100μ1／well入れ，3時間室温で反応させる。洗浄後，Detection抗体（PEPROTECH社の500－P59Bt）0，5　mg／mlを100μ1／well入れ，2時間室温で反応させて，洗浄後，streptavidinで30分感作し，洗浄後，アビジンービオチン液を加え，吸光度405nmで測定した。検量線からサンプルの濃度を検出した。結　果1．LPS刺激により誘導されるマスト細胞IL－9mRNA　およびIL－9レセプターmRNA　マスト細胞でのIL－9mRNA発現はLPSでの刺激によって増加した。この発現はLPS濃度依存的に増加し，刺激後4時間でピークを示した。一方，IL－gレセプターのmRNAの発現でのLPS濃度依存性は認められなかったが，恒常的に強い発現を示していた。藍（A）???????【く㈲??????????，＝?????? ?7塵自1．．，L胸‘二8糧コ．：、＝o葦こ‘＝2に鱒℃●・1ロ1㎝畢1’・11昏。．?．????????????苫?．　o　亀Pる　　■　　露。　　華◎o　　零鱒　、開hl．Fig．2　LPSdo∫2駒dopをnderrt　lし95ecρetio貸in　gMMC5≦躍imu13ted　u3詮hLPS．8MMC5（1x10弓oe115加1）u3ere≦臨imu13ted一日h　LP＄2慮the　indio3象edoonce鳳【r翫ion5飴r24　h．　Cu版u陀5upem翫3f雌切erema35ured　fbrcy＝okir1倥1し・9　by　E≡USA，　Oaヒa脚er登pr喰5層目！ed　a5　mean＝ヒSEM　f叙）臨trip：io蹴e賦3を罰s　of3　s馨ngle　exρerimer践3r匪d　r駐P陀5er虞聾of3壱xperirne蹴5：d∈monst昭匙hg　simii3r陀5戚5．CPく0。05）3．LPS刺激による経時的なIL－9産生の変化　LPS刺激によりBMMCからのIL－9産生が見られたことから，次にLPS刺激によるIL－9産生の経時的変化を調べた。その結果，少なくとも48時間までは時間経過にしたがってIL－9の産生量が増加していることが見られたことから，LPSによるBMMCからのIL－9産生は一過性のものではなく比較的長期にわたって，継続することが示唆された。??????? ? ?冨1賄趣，7垂。鰭fく6Fig．羽し93nd　Iし9Rexpr冷55ion　in　8MM　C55！imul欲嘘d切詮hしPS．　MouseBMMC5田e陀5！㎞田翫ed騨訟h　LPS（1　DO　ng制or　1円制）動r　2・12　h．1rbt3！RNA騨35　prep3f塗d脚詮h　l50gen　3nd　5Ψn！he5i＝ed　cDNAw詮h跨v登r客etr3n5c6pta5¢．◎u3敵3tivUし9rnRNA切コ53n3！yzed　by　r陰a卜t㎞ePCR．（沖ウτhe　expr各5ion　ieve150f　lし9切er造det¢πτ∬ned　by　rヒコ1・t㎞ePCRirb　BMMC52●12h3食er≦㎞r』3tioo鱒詮h　v3ry殉珊Q蹴50fしPS．（B）rn㌔藍expr喰∫5㎞Iovds　of　lし9鱒er巴dセ！亀π＝画ned　byr贈謎遭㎞oPCRin　BMMC52．12　hコ食er5timサ1菰ion　w詮h励g訓nour慮s　ofしPS．03惚叫er陰P陀5¢儲！嘘d　35　r1絶2nま＝SE粥鼠）m　tdPlic3艶螂e050歪a5恥gleexper㎞er賦3r図』r登pr喰5erlヒ10f3　exp《≧rimer慮5　d鰭π1｛ひ轟5電rヨ慮和ng　5㎞n醍ar㎎5u肚5．2．LPS濃度依存的に誘導されるマスト細胞IL－9　LPS刺激によりBMMCは1レ9　mRNAを強く発現することから，次にタンパクレベルでの1レ9分泌定量を検討した。すると，LPS刺激に対しBMMCがIL－9の産生が見られ，それはLPS濃度100　ng／ml以上で濃度依存的にIL－9産生量の増加が見られた。このことからBMMCはmRNA発現を伴ってIL－9を産生することから，オートクラインによる増殖が可能であることが強く示唆された。晃?　　　　　　　　　o　　　｝二Ω　　二●ρ　　縄♪　　　　　　　　　　　　1吊○レハ。魑r‘馳Figβ7㎞e　cou蕗e　of　Iレ95ecr磁ion　in　BMMC∬timul萬ed蝋h　LPS・BMMC＄（1xloるce羅5！謡）呪炉e鋸㎞u1菰ed切詮h　Lps（1｝つ舶1）・c伽re　supeπ職ar雌賦陀m 35ur喰d乗）r　cシ！ok恥e　IL。9欲the　indic㌶ed　t己me　poir寵5　byεuSA・D置ta膨e陀pr欝獣edおπ掩3h止S田f沁r厳爵P髄。凱鱒e慨s　of　a　5i勒glセミxpヒ漁ヒr慮蘭drep爬5er慮10f3　expe轟mer慮5　demon5tr＝寵hg　5㎞i1ar　re5u！t5・CP＜0・05）4．LPSおよびサイトカイン共刺激によるIL－9産生　能への影響　LPS刺激によりBMMCは濃度及び時間依存的にIL－9産生を増加することがわかったので，次にマスト細胞の増殖に必須であるIL－3及びSCFがIL－9産生に及ぼす影響を検討した。IL－3とLPSの共刺激によりIL－9の産生量は増加した。　SCFとLPSの共刺激によるIL－9産生への影響は認められなかった。この結果から，LPS刺激でのBMMCから産生されるIL－9によるオートクライン誘導マスト細胞増殖にはIL－3の存在が必須であることが示唆された。l14 麻布大学雑誌　第17・18巻　2008年まとめ??????卸　　1二・臥べ屡》ぜ剛ll　一　　　一　　　十　　　←二量：5、1軌’韮曜婁霞言．瀕　　　←　　　一　　　手ドig♂4∈鞭。電on膣し95ecretion　in　BMMC5co．≦瞳imu罪3ted榔詮h　LPSコnd暮』・3　and’orSCF．　BMMC窪（1x10讐cel15創）輿er登5峨imu！3ヒed　fbr24　h脚i！h　LPS（1　HOノ冒縄）士IL・3（～ng㎞り±SCF（塞Ong細）。Cu詮un臼5upΩm3tar濾5　wer壊me35uredfbrcy！okine書レ9　by　EuSA・03t3切er陰pr冷s鰍ed　35π1e舘士s8）1勧mtriplic議eΨd1≦ofa　5董r19Ie　eXpeτiπber瀧ヨnd　r虐pr造5er腱101F　3金xperirne餓5demo臨にthg　5imi13rr陰5u髭5でPくO・05舘Pく0．01）藩；気議　N難・・撚寒慰．??????????????・BMMCにおいてLPS刺激で，　mRNAレベルでのIL－9が発現していることがわかった。・BMMCにおいてLPS刺激で，タンパクレベルでの1レ9が発現していることがわかった。．BMMCにおいてIL－9はmRNAレベルでもタンパクレベルでもLPS濃度依存的に発現していることがわかった。・BMMCにおいてIL－9の産生にはIL－3が必須であることがわかった。（考察）　前回の成績から推察されたようにBMMCはグラム陰性菌由来LPS刺激に対して，　IL－gをmRNAレベルでもタンパクレベルでも産生することから，IL－gはマスト細胞のグラム陰性菌感染の免疫応答に強く関与していると考えられる。現在，より詳細なIL－9産生機序とin　vivoでこの免疫応答を証明するためのW／wvでの実験を検討中である。

Functional analyses of immune cells against bacterila antigens

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細菌抗原に対する免疫担当細胞の機能解析

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