Uno de los objetivos más desafiantes durante la enseñanza de la bioquímica es la integración de los procesos bioquímicos, por lo que asociarlos con las experiencias cotidianas de los estudiantes puede facilitar su comprensión. La glucólisis es un proceso ubicuo tanto en la vida como en los programas de bioquímica del todo el mundo. A pesar de la importancia de este proceso, son escasas las actividades experimentales enfocadas en dicha ruta metabólica. El objetivo de este estudio fue desarrollar una actividad experimental centrada en la observación del proceso de glucólisis en bacterias extraídas de un yogurt comercial. Esta actividad les permite a los estudiantes observar un proceso bioquímico en un elemento de su vida cotidiana, mientras que desarrollan su habilidad práctica en la aplicación de técnicas bioquímicas básicas, así como su comprensión sobre la glucólisis.One of the most challenging goals in the teaching of biochemistry is the integration of biochemical processes, therefore associating them with student's daily life experiences might facilitate their comprehension. Glycolysis is a ubiquitous process both in life as in biochemistry programs around the world. Despite the importance of this process, there are few experimental activities focused on said metabolic pathway. The objective ofthis study was to develop, and experimental activity focused on the observation of the glycolytic process in bacteria extracted from a commercial yogurt. This activity allows students to observe a biochemical process in an element f their daily life, while at the same time developing their practical skill in the application of basic biochemical techniques as well as their understanding about glycolysis

Gaviria González, Llaraí Carolina

Gaviria Romero Lujambio, Silvia Idalia

Jacobo Reyes, Diana Xiadani

Lopez Arredondo, Erick Jose

Perales Vela, Hugo Virgilio

Vazquez Medrano, Josefina

Spanish

Zaloamati

Revista Tendencias en Docenciae Investigación en Química2018Universidad Autónoma Metropolitana, Ciudad de México130Año 4Número 4Actividad experimental enfocada en la enseñanza de la glucólisisGaviria  Romero Lujambio Silvia Idalia, Gaviria González Llaraí Carolina, Jacobo Reyes Diana Xiadani, López Arredondo Erick José, Vázquez Medrano Josefina, Perales Vela Hugo Virgilio*.Universidad Nacional Autónoma de México, Módulo de Biomoléculas, Carrera de Biología, Facultad de Estudios Superiores Iztacala. Avenida de los Barrios Número 1. Los Reyes Iztacala, Tlalnepantla, Estado de México. C.P. 54090.*Autor para correspondencia: hugo.perales@gmail.comRecibido: 27/junio/2018Aceptado: 21/julio/2018Palabras claveGlucólisis, inhibición, metabolismoKeywordsGlycolisis, inhibition, metabolismRESUMENUno de los objetivos más desafiantes durante la enseñanza de la bioquímica es la integración de los procesos bioquímicos, por lo que asociarlos con las experiencias cotidianas de los estudiantes puede facilitar su comprensión. La glucólisis es un proceso ubicuo tanto en la vida como en los programas de bioquímica del todo el mundo. A pesar de la importancia de este proceso, son escasas las actividades experimentales enfocadas en dicha ruta metabólica.  El objetivo de este estudio fue desarrollar una actividad experimental centrada en la observación del proceso de glucólisis en bacterias extraídas de un yogurt comercial. Esta actividad les permite a los estudiantes observar un proceso bioquímico en un elemento de su vida cotidiana, mientras que desarrollan su habilidad práctica en la aplicación de técnicas bioquímicas básicas, así como su comprensión sobre la glucólisis. ABSTRACTOne of the most challenging goals in the teaching of biochemistry is the integration of biochemical processes, therefore associating them with student’s daily life experiences might facilitate their comprehension. Glycolysis is a ubiquitous process both in life as in biochemistry programs around the world. Despite the importance of this process, there are few experimental activities focused on said metabolic pathway. The objective of this study was to develop, and experimental activity focused on the observation of the glycolytic process in bacteria extracted from a commercial yogurt. This activity allows students to observe a biochemical process in an element f their daily life, while at the same time developing their practical skill in the application of basic biochemical techniques as well as their understanding about glycolysis. Universidad Autónoma Metropolitana, Ciudad de MéxicoRevista Tendencias en Docenciae Investigación en Química2018Año 3Número 344131Introducción La bioquímica es una asignatura fundamental del tronco común de todas las carreras de las ciencias biológicas. Esta asignatura le permite entender a los estudiantes los procesos químicos fundamentales que ocurren en todos los seres vivos. No obstante, la enseñanza de la bioquímica es un reto constante para los profesores de esta asignatura debido a la complejidad de los procesos bioquímicos (Glew, 2003). Dentro de la bioquímica las vías metabólicas relacionadas con el metabolismo central energético son las más estudiadas. Debido a la importancia de este tema el metabolismo energético debería ser uno de los temas más populares; lamentablemente, esto rara vez se observa en el aula (Rabinowitz y Vastag, 2012). El poco interés en estas vías metabólicas usualmente se debe a que su enseñanza se reduce a hacer que los estudiantes memoricen las vías metabólicas (Rabinowitz y Vastag, 2007). No obstante, se ha observado un incremento en el interés de los estudiantes después de realizar actividades experimentales que relacionen el conocimiento teórico adquirido en las aulas con su vida cotidiana (Gil et al., 1999). La mayoría de las actividades experimentales escolares se diseñan teniendo como referente lo que hacen los científicos, cuando en realidad deberían ser como un guion especialmente diseñado para aprender determinados aspectos de las ciencias, con su propio escenario, es por esto que en el diseño de este experimento se utilizaron lactobacilos de un yogurt comercial, permitiendo que los alumnos puedan relacionar con su vida diaria los resultados que obtienen y el análisis que realizan a partir de ellos.Es posible presentar el metabolismo como una secuencia realista de reacciones (Novelli y Fernandes, 2007). El protocolo de la práctica permitió la integración del conocimiento teórico del proceso de glucólisis con la observación del incremento en la concentración del piruvato a diferentes tiempos. Los experimentos en el laboratorio brindan escenarios para enseñar y aprender, proporcionan a los estudiantes oportunidades para pensar, debatir y resolver problemas reales. Se ha demostrado que los estudiantes aprenden mejor cuando pueden aproximarse al conocimiento y se puede lograr, si asumen un papel activo, haciendo lo que aprendieron (Di Bernardo y Guana, 2016).  A causa de que mejorar la instrucción se ha convertido en una prioridad (Diane y Hakuta, 1997), desarrollar nuevas actividades prácticas permite la transferencia de entrenamiento que es un elemento fundamental durante la enseñanza de la ciencia. A través de las actividades de laboratorio, los estudiantes llegan a comprender los procedimientos de la investigación científica, como; el control de variables, la observación cuidadosa, el registro de datos, y el desarrollo de conclusiones (Hart et al., 2000).Dicho lo anterior y considerando que la experimentación es una base importante del conocimiento y la comprensión científica (Diane y Hakuta, 1997), diseñamos una práctica de laboratorio enfocada en el análisis de la glucólisis. Esta actividad tiene una gran sensibilidad a errores metodológicos, por lo que además es excelente para evaluar las habilidades prácticas adquiridas por los estudiantes. En este trabajo presentamos la metodología para la realización de la práctica y el resultado obtenido por un grupo de estudiantes.   Ejemplificar de forma práctica cómo funciona una ruta metabólica; así como el significado de su inhibición, constituye una estrategia didáctica útil para abordar temas como la glucólisis.Metodología Materiales y reactivos para la actividad experimental Material4 matraces Erlenmeyer de 125 mL.2 pipetas de 10 mL. 1 micro centrifuga.3 vasos de precipitados de 25 mL.1 incubadora a 37 °C.1 micropipeta de 20 a 200 µL.1 micropipeta de 200 a 1000 µL.16 tubos de micro centrifuga de 1.5 mL.1 bureta de 50 mL.1 soporte universal.1 gradilla para tubos Eppendorf.18 tubos de ensayo de 13 x 100.1 gradilla para tubos de vidrio.ReactivosSolución de 2,4-DNFH (Dinitrofenil hidracina).Solución de ácido tricloroacético al 5 %.Solución NaOH 0.6 M.Solución patrón de piruvato de sodio 50 mM.Solución de NaF 5 M.Universidad Autónoma Metropolitana, Ciudad de MéxicoRevista Tendencias en Docenciae Investigación en Química2018Año 3Número 344132Medio mínimo M9 (33.9g/L Na2HPO4,15g/L KH2PO4,5g/L NH4Cl y 2.5g/L NaCl).Descripción de las actividades para estudiantes La actividad experimental consiste en 3 etapas. Durante la primera etapa los estudiantes aíslan y lavan lactobacilos de un yogurt comercial, posteriormente durante la segunda etapa inducen glucólisis en las células teniendo un grupo de células con NaF que inhibe la enolasa y detiene la producción de piruvato, además tienen un grupo control sin NaF. Finalmente, en la tercera etapa cuantifican el piruvato producido por las células durante el experimento. A continuación, describimos la metodología seguida por los estudiantes. A) Separación de lactobacilos1. Transfiera 100 mL de yogurt a un tubo de centrífuga,y centrifugue por 10 minutos a 4000 rpm.2. Deseche el sobrenadante, resuspenda la pastilla en20 mL de medio M9 y vuelva a centrifugar por 10minutos a 4000 rpm.3. Deseche el sobrenadante y resuspenda la pastillaen 20 mL de medio M9, (resguarde sus células, lasutilizará dos veces).4. Deposite las células en un vaso de precipitado de100 mL y cúbralas con un papel aluminio hasta suposterior uso.B) Inducción de la glucólisis1. Tome 5 mL de las células resuspendidas (mezcleligeramente el vaso antes de tomarlas) y colóquelosen un matraz de 125 mL con 50 mL de medio M9.2. Inmediatamente agite el matraz y pase 500 μL de lasolución a un tubo eppendorf limpio, adicione 500 μLde la solución de TCA (ácido tricloroacético) al 5 %, yetiquete el tubo como control.3. Adicione 1 ml de la solución de glucosa al matraz 1(considere el momento en el que adiciona la glucosacomo tiempo 0).4. Repita el punto 1 y etiquete el tubo como glucosatiempo 0.5. Incube el matraz 1 a 37 °C en agitación constante(200 rpm).6. Repita el punto 2 a los 30 y 60 minutos posterioresa la adición de glucosa y etiquete los tubos comoglucosa tiempo 30 y tiempo 60.C) Inducción e inhibición de glucólisis1. Adicione 5 mL de sus células resuspendidas al MedioM9 con glucosa e inhibidor (matraz 2), (considereel momento en el que adiciona sus células como tiempo 0).2. Inmediatamente agite y pase 500 μL de la solucióna un tubo eppendorf limpio, adicione 500 μL dela solución de (ácido tricloroacético) TCA al 5 %,etiquete el tubo como inhibidor tiempo 0.3. Lleve el matraz a incubar a 37 °C.4. También procese las muestras a los 30 y 60 minutosposteriores a la adición de las células al matraz 2.D) Cuantificación del piruvato1. Una vez que tenga sus 7 tubos eppendorf listos,centrifugue a 14000 rpm durante 5 minutos ypase los sobrenadantes a tubos eppendorf limpios,identifíquelos bien, estos constituyen sus muestrasproblema.2. Cuantifique la concentración de piruvato de cada unade las muestras problema, transfiriendo a un tubo devidrio 0.5 ml del problema, 0.5 ml de agua y 1 ml desolución 0.0125 % de 2,4-Dinitrofenil hidracina.3. Incube sus tubos por 10 minutos a 37 °C.4. Adicione 1 ml de NaOH 0.6 N.5. Simultáneamente prepare su curva patrón utilizandola tabla 1 como guía, no olvide incubar los tubos yadicionar el NaOH.6. Lea en el espectrofotómetro a 420 nm.Tabla 1. Elaboración de la curva patrón de piruvato.Tubo PV (mL) DH (mL) Agua mL1 0 1 12 0.020 1 0.9803 0.040 1 0.9604 0.060 1 0.9405 0.080 1 0.9206 0.100 1 0.900DH: Solución 0.0125 % de 2,4-Dinitrofenil hidracina, PV: Patrón de piruvato 50 mMResultados y discusión Se preparó la curva con concentraciones conocidas de piruvato, la cual se utilizó para calcular las concentraciones de piruvato en el medio M9 con Glucosa y el medio M9 con Glucosa más NaF (fluoruro de sodio) como inhibidor (Gráfica 1).El ácido pirúvico o piruvato, es el producto de la glucólisis (Viloche y Vargas, 2009), por lo tanto, una manera de Universidad Autónoma Metropolitana, Ciudad de MéxicoRevista Tendencias en Docenciae Investigación en Química2018Año 3Número 344133medir la actividad glucolítica de Lactobacillus sp. y de identificar el efecto de un inhibidor de su metabolismo puede lograrse por medio de la medición del piruvato. Con la estandarización de la medición de la actividad glucolítica en Lactobacillus sp. se puede demostrar que entre el medio M9 con Glucosa y el medio M9 con Glucosa más NaF como inhibidor, hay diferencias de producción de piruvato.El aumento de la concentración de piruvato cuando no hay inhibidor (NaF) en el medio, se observa en la línea azul de la gráfica 2. Este incremento se debe a que las bacterias, metabolizan glucosa a través la vía Embden-Meyerhof en cantidades significativas en un corto periodo de tiempo (Baeza-Jiménez et al., 2011), al añadir glucosa al medio que contiene Lactobacillus y mantenerlos a una temperatura favorable, las bacterias crecieron en un ambiente ideal. Gráfica 1.  Curva patrón de piruvato.Sin embargo, en el medio al que se adicionó el inhibidor NaF se observa que la concentración de piruvato no incrementa (Gráfica 2).El fluoruro inhibe a la enolasa, que está en la última etapa de la vía glucolítica, pero las enzimas ubicadas en la cadena metabólica antes de la enolasa permanecen activas, y continúan metabolizando la glucosa hasta que se agoten los sustratos (Shalini y Harpreet, 2014), es por esto que se usó como indicador de inhibición de la glucólisis, la producción de piruvato. El efecto del inhibidor de NaF en Lactobacillus se observa en la Gráfica 2 desde el tiempo 0, las bacterias comienzan a tener un rendimiento bajo en la producción de piruvato, contrastando con los estudios in vitro previamente descritos, se demuestra claramente que el fluoruro puede inhibir el metabolismo de carbohidratos por microorganismos orales al inhibir la enolasa y, por consiguiente, el transporte de glucosa a la célula (Hamilton, 1977). Por otro lado, el cambio en la concentración del metabolito que se usa para medir la actividad glucolítica es pequeño, por lo que el resultado es muy sensible, así que requiere que los alumnos mantengan la atención a las actividades que realizan.Gráfica 2.  Concentración de piruvato en tiempos 0, 20, 40, 60 minutos en grupo experimental y controlUniversidad Autónoma Metropolitana, Ciudad de MéxicoRevista Tendencias en Docenciae Investigación en Química2018Año 3Número 344134ConclusionesEl objetivo de este trabajo fue el desarrollar una actividad práctica que les permitiera a los estudiantes observar el proceso de glucólisis en un sistema cotidiano. La práctica aquí descrita permite a los estudiantes monitorear e inhibir el proceso de glucólisis en bacterias obtenidas a partir de un yogurt comercial, lo que no solo favorece que los estudiantes desarrollen habilidades prácticas, sino que actúa como una actividad de refuerzo e integración para el conocimiento teórico de la glucólisis adquirido durante su formación en el aula. AgradecimientosSe agradece a los alumnos y a la profesora Amanda Moreno Rodríguez por participar en la realización de la práctica. Referencias Arteaga, E., Armada, L., Del Sol, J. (2016). La enseñanza de las ciencias en el nuevo milenio. Retos y sugerencias. Revista Universidad y Sociedad, 8(1), 169-176. Baeza-Jiménez, R. Lopez-Martinez, L.X. De la Cruz-Medina, J.; Espinosa de los- Monteros, J.J. García-Galindo, H.S. (2011). Effect of glucose 1,3-propanediol production by Lactobacillus reuteri. Revista Mexicana de Ingeniería Química. 10(1), 39-46Bradley, R. L. (1968). 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Actividad experimental enfocada en la enseñanza de la glucólisis

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