Smidt, Marten Piet

Dissertations of the University of Groningen

   University of GroningenTwo DNA-binding proteins recognizing the apoVLDL-II gene cis-regulatory element DSmidt, Marten PietIMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite fromit. Please check the document version below.Document VersionPublisher's PDF, also known as Version of recordPublication date:1996Link to publication in University of Groningen/UMCG research databaseCitation for published version (APA):Smidt, M. P. (1996). Two DNA-binding proteins recognizing the apoVLDL-II gene cis-regulatory element D.[Thesis fully internal (DIV), University of Groningen]. [s.n.].CopyrightOther than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of theauthor(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).The publication may also be distributed here under the terms of Article 25fa of the Dutch Copyright Act, indicated by the “Taverne” license.More information can be found on the University of Groningen website: https://www.rug.nl/library/open-access/self-archiving-pure/taverne-amendment.Take-down policyIf you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediatelyand investigate your claim.Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons thenumber of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.Download date: 30-10-2023SamenvattingSAMENVATTINGTijdens de ontwikkeling van hogere eukaryote organismen gaan de afzonderlijkecellen een proces van differentiatie door, hetgeen in specifieke fenotypes resulteert. Dit proceswordt in gang gezet door het aan en uitschakelen van genen waarbij de totale genetischeinformatie behouden bhjÍi. Het reguleren van genen gebeurt veelal op het nivo vantranscriptie, d.w.z. het overschrijven van genetische informatie gelegen in het DNA naarRNA. Dit proces wordt verzorgd door RNA polymerases die binden aan een DNA gebied, depromoter, vlak voor de coderende sequenties. De activiteit en bindings efficiëntie van dezepolymerases wordt gereguleerd oor algemene transcriptiefactoren bindend aan de promoter.Tesamen vormen ze het preinitiatie complex. Bij de regulatie van dit proces zijn specifiekeregeleiwitten betrokken die binden aan korte DNA sequenties (10-15 base paren) meestal,maar niet noodzakelijk, in het 5'-flankerende DNA. De combinatie van regeleiwitten,gebonden via hun respectivelijke bindingsplaatsen, bepaalt de activiteir van een gen.Identificatie van deze regeleiwitten kan inzicht verschaffen in het proces van genregulatie. InHoofdstuk I worden die onderwerpen uit het onderzoeksgebied van eukaryote genregulatieingeleid die voor de volgende experimentele hoofdstukken van belang zijn.De kern van het onderzoek beschreven in dit proefschrift is gelegd door de kloneringen karakterisatie van twee DNA-bindende eiwitten afkomstig van de kip. Deze eiwittenhebben affiniteit voor een bepaalde DNA sequentie in het 5'-flankerende gebied van het"very Low Density Apolipoprotein tr" gen (apovLDL Ii). Het apoVLDL tr gen product wordruitsluitend gemaakt in de lever waama het getransporteerd wordt door het bloed naar hetovarium waar het in de ei-dooier wordt ingebouwd. Het apoVLDL Il-gen fungeert in hetonderzoek als een model gen met hormoon-aftrankelijke weefsel-specifieke regulatie. Doorscreening van een kippe-cDNA expressie bank in bacteriophaag À. d.m.v.een specifieke DNA-affiniteitsprobe, kan men kloons verkrijgen die coderen voor eiwitten met de gewenste DNA-bindende eigenschappen. De door ons gekloneerde iwitten binden aan een regetgebied (D-box) dat direct naast de belangrijkste oestrogeen receptor bindingsplaats ligt in het 5'-flankerende DNA van het apoVLDL II gen. Deze complexe binding plaats (ElD) is gekozenvoor nader onderzoek omdat verwacht werd dat eiwitten die daar binden een regulerendewerking uitoefenen op de oestrogeen receptor. In hoofdstuk 2 wordt de klonering beschrevenvan een partieel cDNA, de overlappende genomische sequentie en het volledig cDNA datcodeert vooÍ een leucine zipper eiwit (bZip) dat recent in verband gebracht was metvitellogenine regulatie en daarom Vitellogenine gene Binding Protein (VBP) was genoemd.Het eiwit is tot overexpressie gebrachtin E. coli en gezuiverd. Ruwe E. coli extracten en hetzuivere eiwit zijn gebruikt om de DNA bindingseigenschappen te bepalen. Het bleek dat heteiwit simultaan met de estrogeen receptor kan binden aan de complexe DNA bindingsplaatsen ook nog aan andere gebieden (site F en 82) in het 5'-flankerende DNA. De simultanebinding was veÍrassend aangezien het bZip eiwit een deel van de oestrogeen receptor bindingsplaats bezet. In hoofdstuk 3 komt de vraag aan de orde of het eiwit in staat is de transcriptievan het apoVLDL II gen te beinvloeden en of dit gebeurt in de lever. Het bleek dat het eiwiteen promoter kan activeren die gedreven wordt door 9 kopieen van de bindings plaats D. Eendoor het apoVLDL II 5'-flankerende gebied-gedreven repoÍer activeert slechts minimaal.LSamenvattlngAnalyse van de kerneiwitten toonde aan dat het bZip eiwit niet voorkomt in de kernen vanlevercellen. De eindconclusie is dan ook dat het onwaarschijnlijk is dat het gekloneerderegeleiwit relevant is voor de regulatie van het apoVLDL II gen.In hoofdstuk 4 wordt de klonering van een tot-dan-toe onbekend eiwit beschreven,tesamen met een mogelijke splicings variant, die gekarakteriseerd worden door hunovereenkomst met heteronucleaire ribonucleoproteinen van het A/B type (hnRNP A/B). Hetrecombinante eiwit bindt aan het specifieke DNA gebied dat onze interesse heeft (element D),echter het bindt alleen aan enkelstrengs DNA (de min-streng). Vergeh.lkbare eiwittengevonden in de muis en de mens zijn respectivelijk gekarakeriseerd als remmer en activatorvan transcriptie. Het bleek dat het door ons gekloneerde eiwit een remmend effect kan hebbenop de oestrogeen-geinduceerde apoVLDL II transcriptie. Eiwitten die enkelstrengs DNAbinden zijn gerapporteerd in de literatuur, echter er is weinig duidelijke evidentie voor hunfunctie als regeleiwit. In verband met het voorgaande zijn de verschillende functioneledomeinen binnen het enkelstrengs DNA bindend eiwit verder geanalyseerd. Het resultaat isbeschreven in hoofdstuk 5. Het enkelstrengs DNA bindings domain is gelocaliseerd in hetcentrale deel van het eiwit dat gekarakteriseerd wordt door een gedupliceerd segment van 75amino zuren. Beide gebieden zijn noodzakelijk voor DNA bindingsactiviteit. Verder bleek datDNA binding niet belangrijk is voor de remmende werking op transcriptie. De eiwitgebiedenvan belang voor de remmende werking liggen in de N-terminus. Het eiwit was aantoonbaaraanwezig in leverkernen en dit tezamen met de functie karakterisatie maakt de relevantie vanhet eiwit voor de regulering van het apoVLDL II gen twijfelachtig. Om toch het uiteindelijkedoelsysteem van dit eiwit te achterhalen is het transcriptie patroon bepaald en het regel-DNAgebied van dit eiwit gekloneerd. De klonering en analyse staan vermeld in hoofdstuk 6. Hetlijkt er op dat het gen voornamelijk geactiveerd is in snel delende weefsels zoals in embryoweefsel en cellijnen. Deze activatie is mogelijk te relateren aan regelgebieden gevonden in het5'-flankerende DNA specifiek voor de cel-cyclus gerelateerde transcriptie factor E2F. Naastdeze DNA elementen zijn DNA bindingsplaatsen voor de algemene transcriptie factor SPIgevonden. De E2F DNA bindingsplaatsen, en soms de combinatie met SPl. zi jn ookgevonden in andere genen die tot expressie komen in de G1/S transitie van de cel cyclus. Inhoofdstuk 7 is geprobeerd een overzicht te geven van de gevolgde onderzoeksstrategie, deverkregen resultaten en onderzoeksmoseliikheden voor de toekomst.ddirncnkiIbuOittIcIIIIll 0 l

English

Two DNA-binding proteins recognizing the apoVLDL-II gene cis-regulatory element D

Proceedings - University of Groningen

   University of GroningenTwo DNA-binding proteins recognizing the apoVLDL-II gene cis-regulatory element DSmidt, Marten PietIMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite fromit. Please check the document version below.Document VersionPublisher's PDF, also known as Version of recordPublication date:1996Link to publication in University of Groningen/UMCG research databaseCitation for published version (APA):Smidt, M. P. (1996). Two DNA-binding proteins recognizing the apoVLDL-II gene cis-regulatory element D.[s.n.].CopyrightOther than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of theauthor(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).The publication may also be distributed here under the terms of Article 25fa of the Dutch Copyright Act, indicated by the “Taverne” license.More information can be found on the University of Groningen website: https://www.rug.nl/library/open-access/self-archiving-pure/taverne-amendment.Take-down policyIf you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediatelyand investigate your claim.Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons thenumber of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.Download date: 12-10-2022SamenvattingSAMENVATTINGTijdens de ontwikkeling van hogere eukaryote organismen gaan de afzonderlijkecellen een proces van differentiatie door, hetgeen in specifieke fenotypes resulteert. Dit proceswordt in gang gezet door het aan en uitschakelen van genen waarbij de totale genetischeinformatie behouden bhjÍi. Het reguleren van genen gebeurt veelal op het nivo vantranscriptie, d.w.z. het overschrijven van genetische informatie gelegen in het DNA naarRNA. Dit proces wordt verzorgd door RNA polymerases die binden aan een DNA gebied, depromoter, vlak voor de coderende sequenties. De activiteit en bindings efficiëntie van dezepolymerases wordt gereguleerd oor algemene transcriptiefactoren bindend aan de promoter.Tesamen vormen ze het preinitiatie complex. Bij de regulatie van dit proces zijn specifiekeregeleiwitten betrokken die binden aan korte DNA sequenties (10-15 base paren) meestal,maar niet noodzakelijk, in het 5'-flankerende DNA. De combinatie van regeleiwitten,gebonden via hun respectivelijke bindingsplaatsen, bepaalt de activiteir van een gen.Identificatie van deze regeleiwitten kan inzicht verschaffen in het proces van genregulatie. InHoofdstuk I worden die onderwerpen uit het onderzoeksgebied van eukaryote genregulatieingeleid die voor de volgende experimentele hoofdstukken van belang zijn.De kern van het onderzoek beschreven in dit proefschrift is gelegd door de kloneringen karakterisatie van twee DNA-bindende eiwitten afkomstig van de kip. Deze eiwittenhebben affiniteit voor een bepaalde DNA sequentie in het 5'-flankerende gebied van het"very Low Density Apolipoprotein tr" gen (apovLDL Ii). Het apoVLDL tr gen product wordruitsluitend gemaakt in de lever waama het getransporteerd wordt door het bloed naar hetovarium waar het in de ei-dooier wordt ingebouwd. Het apoVLDL Il-gen fungeert in hetonderzoek als een model gen met hormoon-aftrankelijke weefsel-specifieke regulatie. Doorscreening van een kippe-cDNA expressie bank in bacteriophaag À. d.m.v.een specifieke DNA-affiniteitsprobe, kan men kloons verkrijgen die coderen voor eiwitten met de gewenste DNA-bindende eigenschappen. De door ons gekloneerde iwitten binden aan een regetgebied (D-box) dat direct naast de belangrijkste oestrogeen receptor bindingsplaats ligt in het 5'-flankerende DNA van het apoVLDL II gen. Deze complexe binding plaats (ElD) is gekozenvoor nader onderzoek omdat verwacht werd dat eiwitten die daar binden een regulerendewerking uitoefenen op de oestrogeen receptor. In hoofdstuk 2 wordt de klonering beschrevenvan een partieel cDNA, de overlappende genomische sequentie en het volledig cDNA datcodeert vooÍ een leucine zipper eiwit (bZip) dat recent in verband gebracht was metvitellogenine regulatie en daarom Vitellogenine gene Binding Protein (VBP) was genoemd.Het eiwit is tot overexpressie gebrachtin E. coli en gezuiverd. Ruwe E. coli extracten en hetzuivere eiwit zijn gebruikt om de DNA bindingseigenschappen te bepalen. Het bleek dat heteiwit simultaan met de estrogeen receptor kan binden aan de complexe DNA bindingsplaatsen ook nog aan andere gebieden (site F en 82) in het 5'-flankerende DNA. De simultanebinding was veÍrassend aangezien het bZip eiwit een deel van de oestrogeen receptor bindingsplaats bezet. In hoofdstuk 3 komt de vraag aan de orde of het eiwit in staat is de transcriptievan het apoVLDL II gen te beinvloeden en of dit gebeurt in de lever. Het bleek dat het eiwiteen promoter kan activeren die gedreven wordt door 9 kopieen van de bindings plaats D. Eendoor het apoVLDL II 5'-flankerende gebied-gedreven repoÍer activeert slechts minimaal.LSamenvattlngAnalyse van de kerneiwitten toonde aan dat het bZip eiwit niet voorkomt in de kernen vanlevercellen. De eindconclusie is dan ook dat het onwaarschijnlijk is dat het gekloneerderegeleiwit relevant is voor de regulatie van het apoVLDL II gen.In hoofdstuk 4 wordt de klonering van een tot-dan-toe onbekend eiwit beschreven,tesamen met een mogelijke splicings variant, die gekarakteriseerd worden door hunovereenkomst met heteronucleaire ribonucleoproteinen van het A/B type (hnRNP A/B). Hetrecombinante eiwit bindt aan het specifieke DNA gebied dat onze interesse heeft (element D),echter het bindt alleen aan enkelstrengs DNA (de min-streng). Vergeh.lkbare eiwittengevonden in de muis en de mens zijn respectivelijk gekarakeriseerd als remmer en activatorvan transcriptie. Het bleek dat het door ons gekloneerde eiwit een remmend effect kan hebbenop de oestrogeen-geinduceerde apoVLDL II transcriptie. Eiwitten die enkelstrengs DNAbinden zijn gerapporteerd in de literatuur, echter er is weinig duidelijke evidentie voor hunfunctie als regeleiwit. In verband met het voorgaande zijn de verschillende functioneledomeinen binnen het enkelstrengs DNA bindend eiwit verder geanalyseerd. Het resultaat isbeschreven in hoofdstuk 5. Het enkelstrengs DNA bindings domain is gelocaliseerd in hetcentrale deel van het eiwit dat gekarakteriseerd wordt door een gedupliceerd segment van 75amino zuren. Beide gebieden zijn noodzakelijk voor DNA bindingsactiviteit. Verder bleek datDNA binding niet belangrijk is voor de remmende werking op transcriptie. De eiwitgebiedenvan belang voor de remmende werking liggen in de N-terminus. Het eiwit was aantoonbaaraanwezig in leverkernen en dit tezamen met de functie karakterisatie maakt de relevantie vanhet eiwit voor de regulering van het apoVLDL II gen twijfelachtig. Om toch het uiteindelijkedoelsysteem van dit eiwit te achterhalen is het transcriptie patroon bepaald en het regel-DNAgebied van dit eiwit gekloneerd. De klonering en analyse staan vermeld in hoofdstuk 6. Hetlijkt er op dat het gen voornamelijk geactiveerd is in snel delende weefsels zoals in embryoweefsel en cellijnen. Deze activatie is mogelijk te relateren aan regelgebieden gevonden in het5'-flankerende DNA specifiek voor de cel-cyclus gerelateerde transcriptie factor E2F. Naastdeze DNA elementen zijn DNA bindingsplaatsen voor de algemene transcriptie factor SPIgevonden. De E2F DNA bindingsplaatsen, en soms de combinatie met SPl. zi jn ookgevonden in andere genen die tot expressie komen in de G1/S transitie van de cel cyclus. Inhoofdstuk 7 is geprobeerd een overzicht te geven van de gevolgde onderzoeksstrategie, deverkregen resultaten en onderzoeksmoseliikheden voor de toekomst.ddirncnkiIbuOittIcIIIIll 0 l

Dutch

NARCIS 

   University of GroningenTwo DNA-binding proteins recognizing the apoVLDL-II gene cis-regulatory element DSmidt, Marten PietIMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite fromit. Please check the document version below.Document VersionPublisher's PDF, also known as Version of recordPublication date:1996Link to publication in University of Groningen/UMCG research databaseCitation for published version (APA):Smidt, M. P. (1996). Two DNA-binding proteins recognizing the apoVLDL-II gene cis-regulatory element D.[Thesis fully internal (DIV), University of Groningen]. [s.n.].CopyrightOther than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of theauthor(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).The publication may also be distributed here under the terms of Article 25fa of the Dutch Copyright Act, indicated by the “Taverne” license.More information can be found on the University of Groningen website: https://www.rug.nl/library/open-access/self-archiving-pure/taverne-amendment.Take-down policyIf you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediatelyand investigate your claim.Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons thenumber of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.Download date: 31-10-2023SamenvattingSAMENVATTINGTijdens de ontwikkeling van hogere eukaryote organismen gaan de afzonderlijkecellen een proces van differentiatie door, hetgeen in specifieke fenotypes resulteert. Dit proceswordt in gang gezet door het aan en uitschakelen van genen waarbij de totale genetischeinformatie behouden bhjÍi. Het reguleren van genen gebeurt veelal op het nivo vantranscriptie, d.w.z. het overschrijven van genetische informatie gelegen in het DNA naarRNA. Dit proces wordt verzorgd door RNA polymerases die binden aan een DNA gebied, depromoter, vlak voor de coderende sequenties. De activiteit en bindings efficiëntie van dezepolymerases wordt gereguleerd oor algemene transcriptiefactoren bindend aan de promoter.Tesamen vormen ze het preinitiatie complex. Bij de regulatie van dit proces zijn specifiekeregeleiwitten betrokken die binden aan korte DNA sequenties (10-15 base paren) meestal,maar niet noodzakelijk, in het 5'-flankerende DNA. De combinatie van regeleiwitten,gebonden via hun respectivelijke bindingsplaatsen, bepaalt de activiteir van een gen.Identificatie van deze regeleiwitten kan inzicht verschaffen in het proces van genregulatie. InHoofdstuk I worden die onderwerpen uit het onderzoeksgebied van eukaryote genregulatieingeleid die voor de volgende experimentele hoofdstukken van belang zijn.De kern van het onderzoek beschreven in dit proefschrift is gelegd door de kloneringen karakterisatie van twee DNA-bindende eiwitten afkomstig van de kip. Deze eiwittenhebben affiniteit voor een bepaalde DNA sequentie in het 5'-flankerende gebied van het"very Low Density Apolipoprotein tr" gen (apovLDL Ii). Het apoVLDL tr gen product wordruitsluitend gemaakt in de lever waama het getransporteerd wordt door het bloed naar hetovarium waar het in de ei-dooier wordt ingebouwd. Het apoVLDL Il-gen fungeert in hetonderzoek als een model gen met hormoon-aftrankelijke weefsel-specifieke regulatie. Doorscreening van een kippe-cDNA expressie bank in bacteriophaag À. d.m.v.een specifieke DNA-affiniteitsprobe, kan men kloons verkrijgen die coderen voor eiwitten met de gewenste DNA-bindende eigenschappen. De door ons gekloneerde iwitten binden aan een regetgebied (D-box) dat direct naast de belangrijkste oestrogeen receptor bindingsplaats ligt in het 5'-flankerende DNA van het apoVLDL II gen. Deze complexe binding plaats (ElD) is gekozenvoor nader onderzoek omdat verwacht werd dat eiwitten die daar binden een regulerendewerking uitoefenen op de oestrogeen receptor. In hoofdstuk 2 wordt de klonering beschrevenvan een partieel cDNA, de overlappende genomische sequentie en het volledig cDNA datcodeert vooÍ een leucine zipper eiwit (bZip) dat recent in verband gebracht was metvitellogenine regulatie en daarom Vitellogenine gene Binding Protein (VBP) was genoemd.Het eiwit is tot overexpressie gebrachtin E. coli en gezuiverd. Ruwe E. coli extracten en hetzuivere eiwit zijn gebruikt om de DNA bindingseigenschappen te bepalen. Het bleek dat heteiwit simultaan met de estrogeen receptor kan binden aan de complexe DNA bindingsplaatsen ook nog aan andere gebieden (site F en 82) in het 5'-flankerende DNA. De simultanebinding was veÍrassend aangezien het bZip eiwit een deel van de oestrogeen receptor bindingsplaats bezet. In hoofdstuk 3 komt de vraag aan de orde of het eiwit in staat is de transcriptievan het apoVLDL II gen te beinvloeden en of dit gebeurt in de lever. Het bleek dat het eiwiteen promoter kan activeren die gedreven wordt door 9 kopieen van de bindings plaats D. Eendoor het apoVLDL II 5'-flankerende gebied-gedreven repoÍer activeert slechts minimaal.LSamenvattlngAnalyse van de kerneiwitten toonde aan dat het bZip eiwit niet voorkomt in de kernen vanlevercellen. De eindconclusie is dan ook dat het onwaarschijnlijk is dat het gekloneerderegeleiwit relevant is voor de regulatie van het apoVLDL II gen.In hoofdstuk 4 wordt de klonering van een tot-dan-toe onbekend eiwit beschreven,tesamen met een mogelijke splicings variant, die gekarakteriseerd worden door hunovereenkomst met heteronucleaire ribonucleoproteinen van het A/B type (hnRNP A/B). Hetrecombinante eiwit bindt aan het specifieke DNA gebied dat onze interesse heeft (element D),echter het bindt alleen aan enkelstrengs DNA (de min-streng). Vergeh.lkbare eiwittengevonden in de muis en de mens zijn respectivelijk gekarakeriseerd als remmer en activatorvan transcriptie. Het bleek dat het door ons gekloneerde eiwit een remmend effect kan hebbenop de oestrogeen-geinduceerde apoVLDL II transcriptie. Eiwitten die enkelstrengs DNAbinden zijn gerapporteerd in de literatuur, echter er is weinig duidelijke evidentie voor hunfunctie als regeleiwit. In verband met het voorgaande zijn de verschillende functioneledomeinen binnen het enkelstrengs DNA bindend eiwit verder geanalyseerd. Het resultaat isbeschreven in hoofdstuk 5. Het enkelstrengs DNA bindings domain is gelocaliseerd in hetcentrale deel van het eiwit dat gekarakteriseerd wordt door een gedupliceerd segment van 75amino zuren. Beide gebieden zijn noodzakelijk voor DNA bindingsactiviteit. Verder bleek datDNA binding niet belangrijk is voor de remmende werking op transcriptie. De eiwitgebiedenvan belang voor de remmende werking liggen in de N-terminus. Het eiwit was aantoonbaaraanwezig in leverkernen en dit tezamen met de functie karakterisatie maakt de relevantie vanhet eiwit voor de regulering van het apoVLDL II gen twijfelachtig. Om toch het uiteindelijkedoelsysteem van dit eiwit te achterhalen is het transcriptie patroon bepaald en het regel-DNAgebied van dit eiwit gekloneerd. De klonering en analyse staan vermeld in hoofdstuk 6. Hetlijkt er op dat het gen voornamelijk geactiveerd is in snel delende weefsels zoals in embryoweefsel en cellijnen. Deze activatie is mogelijk te relateren aan regelgebieden gevonden in het5'-flankerende DNA specifiek voor de cel-cyclus gerelateerde transcriptie factor E2F. Naastdeze DNA elementen zijn DNA bindingsplaatsen voor de algemene transcriptie factor SPIgevonden. De E2F DNA bindingsplaatsen, en soms de combinatie met SPl. zi jn ookgevonden in andere genen die tot expressie komen in de G1/S transitie van de cel cyclus. Inhoofdstuk 7 is geprobeerd een overzicht te geven van de gevolgde onderzoeksstrategie, deverkregen resultaten en onderzoeksmoseliikheden voor de toekomst.ddirncnkiIbuOittIcIIIIll 0 l

University of Groningen

   University of GroningenTwo DNA-binding proteins recognizing the apoVLDL-II gene cis-regulatory element D.Smidt, Marten PietIMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite fromit. Please check the document version below.Document VersionPublisher's PDF, also known as Version of recordPublication date:2009Link to publication in University of Groningen/UMCG research databaseCitation for published version (APA):Smidt, M. P. (2009). Two DNA-binding proteins recognizing the apoVLDL-II gene cis-regulatory element D.s.n.CopyrightOther than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of theauthor(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).Take-down policyIf you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediatelyand investigate your claim.Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons thenumber of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.Download date: 12-11-2019SamenvattingSAMENVATTINGTijdens de ontwikkeling van hogere eukaryote organismen gaan de afzonderlijkecellen een proces van differentiatie door, hetgeen in specifieke fenotypes resulteert. Dit proceswordt in gang gezet door het aan en uitschakelen van genen waarbij de totale genetischeinformatie behouden bhjÍi. Het reguleren van genen gebeurt veelal op het nivo vantranscriptie, d.w.z. het overschrijven van genetische informatie gelegen in het DNA naarRNA. Dit proces wordt verzorgd door RNA polymerases die binden aan een DNA gebied, depromoter, vlak voor de coderende sequenties. De activiteit en bindings efficiëntie van dezepolymerases wordt gereguleerd oor algemene transcriptiefactoren bindend aan de promoter.Tesamen vormen ze het preinitiatie complex. Bij de regulatie van dit proces zijn specifiekeregeleiwitten betrokken die binden aan korte DNA sequenties (10-15 base paren) meestal,maar niet noodzakelijk, in het 5'-flankerende DNA. De combinatie van regeleiwitten,gebonden via hun respectivelijke bindingsplaatsen, bepaalt de activiteir van een gen.Identificatie van deze regeleiwitten kan inzicht verschaffen in het proces van genregulatie. InHoofdstuk I worden die onderwerpen uit het onderzoeksgebied van eukaryote genregulatieingeleid die voor de volgende experimentele hoofdstukken van belang zijn.De kern van het onderzoek beschreven in dit proefschrift is gelegd door de kloneringen karakterisatie van twee DNA-bindende eiwitten afkomstig van de kip. Deze eiwittenhebben affiniteit voor een bepaalde DNA sequentie in het 5'-flankerende gebied van het"very Low Density Apolipoprotein tr" gen (apovLDL Ii). Het apoVLDL tr gen product wordruitsluitend gemaakt in de lever waama het getransporteerd wordt door het bloed naar hetovarium waar het in de ei-dooier wordt ingebouwd. Het apoVLDL Il-gen fungeert in hetonderzoek als een model gen met hormoon-aftrankelijke weefsel-specifieke regulatie. Doorscreening van een kippe-cDNA expressie bank in bacteriophaag À. d.m.v.een specifieke DNA-affiniteitsprobe, kan men kloons verkrijgen die coderen voor eiwitten met de gewenste DNA-bindende eigenschappen. De door ons gekloneerde iwitten binden aan een regetgebied (D-box) dat direct naast de belangrijkste oestrogeen receptor bindingsplaats ligt in het 5'-flankerende DNA van het apoVLDL II gen. Deze complexe binding plaats (ElD) is gekozenvoor nader onderzoek omdat verwacht werd dat eiwitten die daar binden een regulerendewerking uitoefenen op de oestrogeen receptor. In hoofdstuk 2 wordt de klonering beschrevenvan een partieel cDNA, de overlappende genomische sequentie en het volledig cDNA datcodeert vooÍ een leucine zipper eiwit (bZip) dat recent in verband gebracht was metvitellogenine regulatie en daarom Vitellogenine gene Binding Protein (VBP) was genoemd.Het eiwit is tot overexpressie gebrachtin E. coli en gezuiverd. Ruwe E. coli extracten en hetzuivere eiwit zijn gebruikt om de DNA bindingseigenschappen te bepalen. Het bleek dat heteiwit simultaan met de estrogeen receptor kan binden aan de complexe DNA bindingsplaatsen ook nog aan andere gebieden (site F en 82) in het 5'-flankerende DNA. De simultanebinding was veÍrassend aangezien het bZip eiwit een deel van de oestrogeen receptor bindingsplaats bezet. In hoofdstuk 3 komt de vraag aan de orde of het eiwit in staat is de transcriptievan het apoVLDL II gen te beinvloeden en of dit gebeurt in de lever. Het bleek dat het eiwiteen promoter kan activeren die gedreven wordt door 9 kopieen van de bindings plaats D. Eendoor het apoVLDL II 5'-flankerende gebied-gedreven repoÍer activeert slechts minimaal.LSamenvattlngAnalyse van de kerneiwitten toonde aan dat het bZip eiwit niet voorkomt in de kernen vanlevercellen. De eindconclusie is dan ook dat het onwaarschijnlijk is dat het gekloneerderegeleiwit relevant is voor de regulatie van het apoVLDL II gen.In hoofdstuk 4 wordt de klonering van een tot-dan-toe onbekend eiwit beschreven,tesamen met een mogelijke splicings variant, die gekarakteriseerd worden door hunovereenkomst met heteronucleaire ribonucleoproteinen van het A/B type (hnRNP A/B). Hetrecombinante eiwit bindt aan het specifieke DNA gebied dat onze interesse heeft (element D),echter het bindt alleen aan enkelstrengs DNA (de min-streng). Vergeh.lkbare eiwittengevonden in de muis en de mens zijn respectivelijk gekarakeriseerd als remmer en activatorvan transcriptie. Het bleek dat het door ons gekloneerde eiwit een remmend effect kan hebbenop de oestrogeen-geinduceerde apoVLDL II transcriptie. Eiwitten die enkelstrengs DNAbinden zijn gerapporteerd in de literatuur, echter er is weinig duidelijke evidentie voor hunfunctie als regeleiwit. In verband met het voorgaande zijn de verschillende functioneledomeinen binnen het enkelstrengs DNA bindend eiwit verder geanalyseerd. Het resultaat isbeschreven in hoofdstuk 5. Het enkelstrengs DNA bindings domain is gelocaliseerd in hetcentrale deel van het eiwit dat gekarakteriseerd wordt door een gedupliceerd segment van 75amino zuren. Beide gebieden zijn noodzakelijk voor DNA bindingsactiviteit. Verder bleek datDNA binding niet belangrijk is voor de remmende werking op transcriptie. De eiwitgebiedenvan belang voor de remmende werking liggen in de N-terminus. Het eiwit was aantoonbaaraanwezig in leverkernen en dit tezamen met de functie karakterisatie maakt de relevantie vanhet eiwit voor de regulering van het apoVLDL II gen twijfelachtig. Om toch het uiteindelijkedoelsysteem van dit eiwit te achterhalen is het transcriptie patroon bepaald en het regel-DNAgebied van dit eiwit gekloneerd. De klonering en analyse staan vermeld in hoofdstuk 6. Hetlijkt er op dat het gen voornamelijk geactiveerd is in snel delende weefsels zoals in embryoweefsel en cellijnen. Deze activatie is mogelijk te relateren aan regelgebieden gevonden in het5'-flankerende DNA specifiek voor de cel-cyclus gerelateerde transcriptie factor E2F. Naastdeze DNA elementen zijn DNA bindingsplaatsen voor de algemene transcriptie factor SPIgevonden. De E2F DNA bindingsplaatsen, en soms de combinatie met SPl. zi jn ookgevonden in andere genen die tot expressie komen in de G1/S transitie van de cel cyclus. Inhoofdstuk 7 is geprobeerd een overzicht te geven van de gevolgde onderzoeksstrategie, deverkregen resultaten en onderzoeksmoseliikheden voor de toekomst.ddirncnkiIbuOittIcIIIIll 0 l

   University of GroningenTwo DNA-binding proteins recognizing the apoVLDL-II gene cis-regulatory element DSmidt, Marten PietIMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite fromit. Please check the document version below.Document VersionPublisher's PDF, also known as Version of recordPublication date:1996Link to publication in University of Groningen/UMCG research databaseCitation for published version (APA):Smidt, M. P. (1996). Two DNA-binding proteins recognizing the apoVLDL-II gene cis-regulatory element D.[Thesis fully internal (DIV), University of Groningen]. [s.n.].CopyrightOther than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of theauthor(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).The publication may also be distributed here under the terms of Article 25fa of the Dutch Copyright Act, indicated by the “Taverne” license.More information can be found on the University of Groningen website: https://www.rug.nl/library/open-access/self-archiving-pure/taverne-amendment.Take-down policyIf you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediatelyand investigate your claim.Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons thenumber of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.Download date: 16-07-2023SamenvattingSAMENVATTINGTijdens de ontwikkeling van hogere eukaryote organismen gaan de afzonderlijkecellen een proces van differentiatie door, hetgeen in specifieke fenotypes resulteert. Dit proceswordt in gang gezet door het aan en uitschakelen van genen waarbij de totale genetischeinformatie behouden bhjÍi. Het reguleren van genen gebeurt veelal op het nivo vantranscriptie, d.w.z. het overschrijven van genetische informatie gelegen in het DNA naarRNA. Dit proces wordt verzorgd door RNA polymerases die binden aan een DNA gebied, depromoter, vlak voor de coderende sequenties. De activiteit en bindings efficiëntie van dezepolymerases wordt gereguleerd oor algemene transcriptiefactoren bindend aan de promoter.Tesamen vormen ze het preinitiatie complex. Bij de regulatie van dit proces zijn specifiekeregeleiwitten betrokken die binden aan korte DNA sequenties (10-15 base paren) meestal,maar niet noodzakelijk, in het 5'-flankerende DNA. De combinatie van regeleiwitten,gebonden via hun respectivelijke bindingsplaatsen, bepaalt de activiteir van een gen.Identificatie van deze regeleiwitten kan inzicht verschaffen in het proces van genregulatie. InHoofdstuk I worden die onderwerpen uit het onderzoeksgebied van eukaryote genregulatieingeleid die voor de volgende experimentele hoofdstukken van belang zijn.De kern van het onderzoek beschreven in dit proefschrift is gelegd door de kloneringen karakterisatie van twee DNA-bindende eiwitten afkomstig van de kip. Deze eiwittenhebben affiniteit voor een bepaalde DNA sequentie in het 5'-flankerende gebied van het"very Low Density Apolipoprotein tr" gen (apovLDL Ii). Het apoVLDL tr gen product wordruitsluitend gemaakt in de lever waama het getransporteerd wordt door het bloed naar hetovarium waar het in de ei-dooier wordt ingebouwd. Het apoVLDL Il-gen fungeert in hetonderzoek als een model gen met hormoon-aftrankelijke weefsel-specifieke regulatie. Doorscreening van een kippe-cDNA expressie bank in bacteriophaag À. d.m.v.een specifieke DNA-affiniteitsprobe, kan men kloons verkrijgen die coderen voor eiwitten met de gewenste DNA-bindende eigenschappen. De door ons gekloneerde iwitten binden aan een regetgebied (D-box) dat direct naast de belangrijkste oestrogeen receptor bindingsplaats ligt in het 5'-flankerende DNA van het apoVLDL II gen. Deze complexe binding plaats (ElD) is gekozenvoor nader onderzoek omdat verwacht werd dat eiwitten die daar binden een regulerendewerking uitoefenen op de oestrogeen receptor. In hoofdstuk 2 wordt de klonering beschrevenvan een partieel cDNA, de overlappende genomische sequentie en het volledig cDNA datcodeert vooÍ een leucine zipper eiwit (bZip) dat recent in verband gebracht was metvitellogenine regulatie en daarom Vitellogenine gene Binding Protein (VBP) was genoemd.Het eiwit is tot overexpressie gebrachtin E. coli en gezuiverd. Ruwe E. coli extracten en hetzuivere eiwit zijn gebruikt om de DNA bindingseigenschappen te bepalen. Het bleek dat heteiwit simultaan met de estrogeen receptor kan binden aan de complexe DNA bindingsplaatsen ook nog aan andere gebieden (site F en 82) in het 5'-flankerende DNA. De simultanebinding was veÍrassend aangezien het bZip eiwit een deel van de oestrogeen receptor bindingsplaats bezet. In hoofdstuk 3 komt de vraag aan de orde of het eiwit in staat is de transcriptievan het apoVLDL II gen te beinvloeden en of dit gebeurt in de lever. Het bleek dat het eiwiteen promoter kan activeren die gedreven wordt door 9 kopieen van de bindings plaats D. Eendoor het apoVLDL II 5'-flankerende gebied-gedreven repoÍer activeert slechts minimaal.LSamenvattlngAnalyse van de kerneiwitten toonde aan dat het bZip eiwit niet voorkomt in de kernen vanlevercellen. De eindconclusie is dan ook dat het onwaarschijnlijk is dat het gekloneerderegeleiwit relevant is voor de regulatie van het apoVLDL II gen.In hoofdstuk 4 wordt de klonering van een tot-dan-toe onbekend eiwit beschreven,tesamen met een mogelijke splicings variant, die gekarakteriseerd worden door hunovereenkomst met heteronucleaire ribonucleoproteinen van het A/B type (hnRNP A/B). Hetrecombinante eiwit bindt aan het specifieke DNA gebied dat onze interesse heeft (element D),echter het bindt alleen aan enkelstrengs DNA (de min-streng). Vergeh.lkbare eiwittengevonden in de muis en de mens zijn respectivelijk gekarakeriseerd als remmer en activatorvan transcriptie. Het bleek dat het door ons gekloneerde eiwit een remmend effect kan hebbenop de oestrogeen-geinduceerde apoVLDL II transcriptie. Eiwitten die enkelstrengs DNAbinden zijn gerapporteerd in de literatuur, echter er is weinig duidelijke evidentie voor hunfunctie als regeleiwit. In verband met het voorgaande zijn de verschillende functioneledomeinen binnen het enkelstrengs DNA bindend eiwit verder geanalyseerd. Het resultaat isbeschreven in hoofdstuk 5. Het enkelstrengs DNA bindings domain is gelocaliseerd in hetcentrale deel van het eiwit dat gekarakteriseerd wordt door een gedupliceerd segment van 75amino zuren. Beide gebieden zijn noodzakelijk voor DNA bindingsactiviteit. Verder bleek datDNA binding niet belangrijk is voor de remmende werking op transcriptie. De eiwitgebiedenvan belang voor de remmende werking liggen in de N-terminus. Het eiwit was aantoonbaaraanwezig in leverkernen en dit tezamen met de functie karakterisatie maakt de relevantie vanhet eiwit voor de regulering van het apoVLDL II gen twijfelachtig. Om toch het uiteindelijkedoelsysteem van dit eiwit te achterhalen is het transcriptie patroon bepaald en het regel-DNAgebied van dit eiwit gekloneerd. De klonering en analyse staan vermeld in hoofdstuk 6. Hetlijkt er op dat het gen voornamelijk geactiveerd is in snel delende weefsels zoals in embryoweefsel en cellijnen. Deze activatie is mogelijk te relateren aan regelgebieden gevonden in het5'-flankerende DNA specifiek voor de cel-cyclus gerelateerde transcriptie factor E2F. Naastdeze DNA elementen zijn DNA bindingsplaatsen voor de algemene transcriptie factor SPIgevonden. De E2F DNA bindingsplaatsen, en soms de combinatie met SPl. zi jn ookgevonden in andere genen die tot expressie komen in de G1/S transitie van de cel cyclus. Inhoofdstuk 7 is geprobeerd een overzicht te geven van de gevolgde onderzoeksstrategie, deverkregen resultaten en onderzoeksmoseliikheden voor de toekomst.ddirncnkiIbuOittIcIIIIll 0 l

ARTS repository - University of Groningen

   University of GroningenTwo DNA-binding proteins recognizing the apoVLDL-II gene cis-regulatory element DSmidt, Marten PietIMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite fromit. Please check the document version below.Document VersionPublisher's PDF, also known as Version of recordPublication date:1996Link to publication in University of Groningen/UMCG research databaseCitation for published version (APA):Smidt, M. P. (1996). Two DNA-binding proteins recognizing the apoVLDL-II gene cis-regulatory element D.[Thesis fully internal (DIV), University of Groningen]. [s.n.].CopyrightOther than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of theauthor(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).The publication may also be distributed here under the terms of Article 25fa of the Dutch Copyright Act, indicated by the “Taverne” license.More information can be found on the University of Groningen website: https://www.rug.nl/library/open-access/self-archiving-pure/taverne-amendment.Take-down policyIf you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediatelyand investigate your claim.Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons thenumber of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.Download date: 09-09-2023SamenvattingSAMENVATTINGTijdens de ontwikkeling van hogere eukaryote organismen gaan de afzonderlijkecellen een proces van differentiatie door, hetgeen in specifieke fenotypes resulteert. Dit proceswordt in gang gezet door het aan en uitschakelen van genen waarbij de totale genetischeinformatie behouden bhjÍi. Het reguleren van genen gebeurt veelal op het nivo vantranscriptie, d.w.z. het overschrijven van genetische informatie gelegen in het DNA naarRNA. Dit proces wordt verzorgd door RNA polymerases die binden aan een DNA gebied, depromoter, vlak voor de coderende sequenties. De activiteit en bindings efficiëntie van dezepolymerases wordt gereguleerd oor algemene transcriptiefactoren bindend aan de promoter.Tesamen vormen ze het preinitiatie complex. Bij de regulatie van dit proces zijn specifiekeregeleiwitten betrokken die binden aan korte DNA sequenties (10-15 base paren) meestal,maar niet noodzakelijk, in het 5'-flankerende DNA. De combinatie van regeleiwitten,gebonden via hun respectivelijke bindingsplaatsen, bepaalt de activiteir van een gen.Identificatie van deze regeleiwitten kan inzicht verschaffen in het proces van genregulatie. InHoofdstuk I worden die onderwerpen uit het onderzoeksgebied van eukaryote genregulatieingeleid die voor de volgende experimentele hoofdstukken van belang zijn.De kern van het onderzoek beschreven in dit proefschrift is gelegd door de kloneringen karakterisatie van twee DNA-bindende eiwitten afkomstig van de kip. Deze eiwittenhebben affiniteit voor een bepaalde DNA sequentie in het 5'-flankerende gebied van het"very Low Density Apolipoprotein tr" gen (apovLDL Ii). Het apoVLDL tr gen product wordruitsluitend gemaakt in de lever waama het getransporteerd wordt door het bloed naar hetovarium waar het in de ei-dooier wordt ingebouwd. Het apoVLDL Il-gen fungeert in hetonderzoek als een model gen met hormoon-aftrankelijke weefsel-specifieke regulatie. Doorscreening van een kippe-cDNA expressie bank in bacteriophaag À. d.m.v.een specifieke DNA-affiniteitsprobe, kan men kloons verkrijgen die coderen voor eiwitten met de gewenste DNA-bindende eigenschappen. De door ons gekloneerde iwitten binden aan een regetgebied (D-box) dat direct naast de belangrijkste oestrogeen receptor bindingsplaats ligt in het 5'-flankerende DNA van het apoVLDL II gen. Deze complexe binding plaats (ElD) is gekozenvoor nader onderzoek omdat verwacht werd dat eiwitten die daar binden een regulerendewerking uitoefenen op de oestrogeen receptor. In hoofdstuk 2 wordt de klonering beschrevenvan een partieel cDNA, de overlappende genomische sequentie en het volledig cDNA datcodeert vooÍ een leucine zipper eiwit (bZip) dat recent in verband gebracht was metvitellogenine regulatie en daarom Vitellogenine gene Binding Protein (VBP) was genoemd.Het eiwit is tot overexpressie gebrachtin E. coli en gezuiverd. Ruwe E. coli extracten en hetzuivere eiwit zijn gebruikt om de DNA bindingseigenschappen te bepalen. Het bleek dat heteiwit simultaan met de estrogeen receptor kan binden aan de complexe DNA bindingsplaatsen ook nog aan andere gebieden (site F en 82) in het 5'-flankerende DNA. De simultanebinding was veÍrassend aangezien het bZip eiwit een deel van de oestrogeen receptor bindingsplaats bezet. In hoofdstuk 3 komt de vraag aan de orde of het eiwit in staat is de transcriptievan het apoVLDL II gen te beinvloeden en of dit gebeurt in de lever. Het bleek dat het eiwiteen promoter kan activeren die gedreven wordt door 9 kopieen van de bindings plaats D. Eendoor het apoVLDL II 5'-flankerende gebied-gedreven repoÍer activeert slechts minimaal.LSamenvattlngAnalyse van de kerneiwitten toonde aan dat het bZip eiwit niet voorkomt in de kernen vanlevercellen. De eindconclusie is dan ook dat het onwaarschijnlijk is dat het gekloneerderegeleiwit relevant is voor de regulatie van het apoVLDL II gen.In hoofdstuk 4 wordt de klonering van een tot-dan-toe onbekend eiwit beschreven,tesamen met een mogelijke splicings variant, die gekarakteriseerd worden door hunovereenkomst met heteronucleaire ribonucleoproteinen van het A/B type (hnRNP A/B). Hetrecombinante eiwit bindt aan het specifieke DNA gebied dat onze interesse heeft (element D),echter het bindt alleen aan enkelstrengs DNA (de min-streng). Vergeh.lkbare eiwittengevonden in de muis en de mens zijn respectivelijk gekarakeriseerd als remmer en activatorvan transcriptie. Het bleek dat het door ons gekloneerde eiwit een remmend effect kan hebbenop de oestrogeen-geinduceerde apoVLDL II transcriptie. Eiwitten die enkelstrengs DNAbinden zijn gerapporteerd in de literatuur, echter er is weinig duidelijke evidentie voor hunfunctie als regeleiwit. In verband met het voorgaande zijn de verschillende functioneledomeinen binnen het enkelstrengs DNA bindend eiwit verder geanalyseerd. Het resultaat isbeschreven in hoofdstuk 5. Het enkelstrengs DNA bindings domain is gelocaliseerd in hetcentrale deel van het eiwit dat gekarakteriseerd wordt door een gedupliceerd segment van 75amino zuren. Beide gebieden zijn noodzakelijk voor DNA bindingsactiviteit. Verder bleek datDNA binding niet belangrijk is voor de remmende werking op transcriptie. De eiwitgebiedenvan belang voor de remmende werking liggen in de N-terminus. Het eiwit was aantoonbaaraanwezig in leverkernen en dit tezamen met de functie karakterisatie maakt de relevantie vanhet eiwit voor de regulering van het apoVLDL II gen twijfelachtig. Om toch het uiteindelijkedoelsysteem van dit eiwit te achterhalen is het transcriptie patroon bepaald en het regel-DNAgebied van dit eiwit gekloneerd. De klonering en analyse staan vermeld in hoofdstuk 6. Hetlijkt er op dat het gen voornamelijk geactiveerd is in snel delende weefsels zoals in embryoweefsel en cellijnen. Deze activatie is mogelijk te relateren aan regelgebieden gevonden in het5'-flankerende DNA specifiek voor de cel-cyclus gerelateerde transcriptie factor E2F. Naastdeze DNA elementen zijn DNA bindingsplaatsen voor de algemene transcriptie factor SPIgevonden. De E2F DNA bindingsplaatsen, en soms de combinatie met SPl. zi jn ookgevonden in andere genen die tot expressie komen in de G1/S transitie van de cel cyclus. Inhoofdstuk 7 is geprobeerd een overzicht te geven van de gevolgde onderzoeksstrategie, deverkregen resultaten en onderzoeksmoseliikheden voor de toekomst.ddirncnkiIbuOittIcIIIIll 0 l

   University of GroningenTwo DNA-binding proteins recognizing the apoVLDL-II gene cis-regulatory element DSmidt, Marten PietIMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite fromit. Please check the document version below.Document VersionPublisher's PDF, also known as Version of recordPublication date:1996Link to publication in University of Groningen/UMCG research databaseCitation for published version (APA):Smidt, M. P. (1996). Two DNA-binding proteins recognizing the apoVLDL-II gene cis-regulatory element D.[s.n.].CopyrightOther than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of theauthor(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).The publication may also be distributed here under the terms of Article 25fa of the Dutch Copyright Act, indicated by the “Taverne” license.More information can be found on the University of Groningen website: https://www.rug.nl/library/open-access/self-archiving-pure/taverne-amendment.Take-down policyIf you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediatelyand investigate your claim.Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons thenumber of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.Download date: 07-06-2022SamenvattingSAMENVATTINGTijdens de ontwikkeling van hogere eukaryote organismen gaan de afzonderlijkecellen een proces van differentiatie door, hetgeen in specifieke fenotypes resulteert. Dit proceswordt in gang gezet door het aan en uitschakelen van genen waarbij de totale genetischeinformatie behouden bhjÍi. Het reguleren van genen gebeurt veelal op het nivo vantranscriptie, d.w.z. het overschrijven van genetische informatie gelegen in het DNA naarRNA. Dit proces wordt verzorgd door RNA polymerases die binden aan een DNA gebied, depromoter, vlak voor de coderende sequenties. De activiteit en bindings efficiëntie van dezepolymerases wordt gereguleerd oor algemene transcriptiefactoren bindend aan de promoter.Tesamen vormen ze het preinitiatie complex. Bij de regulatie van dit proces zijn specifiekeregeleiwitten betrokken die binden aan korte DNA sequenties (10-15 base paren) meestal,maar niet noodzakelijk, in het 5'-flankerende DNA. De combinatie van regeleiwitten,gebonden via hun respectivelijke bindingsplaatsen, bepaalt de activiteir van een gen.Identificatie van deze regeleiwitten kan inzicht verschaffen in het proces van genregulatie. InHoofdstuk I worden die onderwerpen uit het onderzoeksgebied van eukaryote genregulatieingeleid die voor de volgende experimentele hoofdstukken van belang zijn.De kern van het onderzoek beschreven in dit proefschrift is gelegd door de kloneringen karakterisatie van twee DNA-bindende eiwitten afkomstig van de kip. Deze eiwittenhebben affiniteit voor een bepaalde DNA sequentie in het 5'-flankerende gebied van het"very Low Density Apolipoprotein tr" gen (apovLDL Ii). Het apoVLDL tr gen product wordruitsluitend gemaakt in de lever waama het getransporteerd wordt door het bloed naar hetovarium waar het in de ei-dooier wordt ingebouwd. Het apoVLDL Il-gen fungeert in hetonderzoek als een model gen met hormoon-aftrankelijke weefsel-specifieke regulatie. Doorscreening van een kippe-cDNA expressie bank in bacteriophaag À. d.m.v.een specifieke DNA-affiniteitsprobe, kan men kloons verkrijgen die coderen voor eiwitten met de gewenste DNA-bindende eigenschappen. De door ons gekloneerde iwitten binden aan een regetgebied (D-box) dat direct naast de belangrijkste oestrogeen receptor bindingsplaats ligt in het 5'-flankerende DNA van het apoVLDL II gen. Deze complexe binding plaats (ElD) is gekozenvoor nader onderzoek omdat verwacht werd dat eiwitten die daar binden een regulerendewerking uitoefenen op de oestrogeen receptor. In hoofdstuk 2 wordt de klonering beschrevenvan een partieel cDNA, de overlappende genomische sequentie en het volledig cDNA datcodeert vooÍ een leucine zipper eiwit (bZip) dat recent in verband gebracht was metvitellogenine regulatie en daarom Vitellogenine gene Binding Protein (VBP) was genoemd.Het eiwit is tot overexpressie gebrachtin E. coli en gezuiverd. Ruwe E. coli extracten en hetzuivere eiwit zijn gebruikt om de DNA bindingseigenschappen te bepalen. Het bleek dat heteiwit simultaan met de estrogeen receptor kan binden aan de complexe DNA bindingsplaatsen ook nog aan andere gebieden (site F en 82) in het 5'-flankerende DNA. De simultanebinding was veÍrassend aangezien het bZip eiwit een deel van de oestrogeen receptor bindingsplaats bezet. In hoofdstuk 3 komt de vraag aan de orde of het eiwit in staat is de transcriptievan het apoVLDL II gen te beinvloeden en of dit gebeurt in de lever. Het bleek dat het eiwiteen promoter kan activeren die gedreven wordt door 9 kopieen van de bindings plaats D. Eendoor het apoVLDL II 5'-flankerende gebied-gedreven repoÍer activeert slechts minimaal.LSamenvattlngAnalyse van de kerneiwitten toonde aan dat het bZip eiwit niet voorkomt in de kernen vanlevercellen. De eindconclusie is dan ook dat het onwaarschijnlijk is dat het gekloneerderegeleiwit relevant is voor de regulatie van het apoVLDL II gen.In hoofdstuk 4 wordt de klonering van een tot-dan-toe onbekend eiwit beschreven,tesamen met een mogelijke splicings variant, die gekarakteriseerd worden door hunovereenkomst met heteronucleaire ribonucleoproteinen van het A/B type (hnRNP A/B). Hetrecombinante eiwit bindt aan het specifieke DNA gebied dat onze interesse heeft (element D),echter het bindt alleen aan enkelstrengs DNA (de min-streng). Vergeh.lkbare eiwittengevonden in de muis en de mens zijn respectivelijk gekarakeriseerd als remmer en activatorvan transcriptie. Het bleek dat het door ons gekloneerde eiwit een remmend effect kan hebbenop de oestrogeen-geinduceerde apoVLDL II transcriptie. Eiwitten die enkelstrengs DNAbinden zijn gerapporteerd in de literatuur, echter er is weinig duidelijke evidentie voor hunfunctie als regeleiwit. In verband met het voorgaande zijn de verschillende functioneledomeinen binnen het enkelstrengs DNA bindend eiwit verder geanalyseerd. Het resultaat isbeschreven in hoofdstuk 5. Het enkelstrengs DNA bindings domain is gelocaliseerd in hetcentrale deel van het eiwit dat gekarakteriseerd wordt door een gedupliceerd segment van 75amino zuren. Beide gebieden zijn noodzakelijk voor DNA bindingsactiviteit. Verder bleek datDNA binding niet belangrijk is voor de remmende werking op transcriptie. De eiwitgebiedenvan belang voor de remmende werking liggen in de N-terminus. Het eiwit was aantoonbaaraanwezig in leverkernen en dit tezamen met de functie karakterisatie maakt de relevantie vanhet eiwit voor de regulering van het apoVLDL II gen twijfelachtig. Om toch het uiteindelijkedoelsysteem van dit eiwit te achterhalen is het transcriptie patroon bepaald en het regel-DNAgebied van dit eiwit gekloneerd. De klonering en analyse staan vermeld in hoofdstuk 6. Hetlijkt er op dat het gen voornamelijk geactiveerd is in snel delende weefsels zoals in embryoweefsel en cellijnen. Deze activatie is mogelijk te relateren aan regelgebieden gevonden in het5'-flankerende DNA specifiek voor de cel-cyclus gerelateerde transcriptie factor E2F. Naastdeze DNA elementen zijn DNA bindingsplaatsen voor de algemene transcriptie factor SPIgevonden. De E2F DNA bindingsplaatsen, en soms de combinatie met SPl. zi jn ookgevonden in andere genen die tot expressie komen in de G1/S transitie van de cel cyclus. Inhoofdstuk 7 is geprobeerd een overzicht te geven van de gevolgde onderzoeksstrategie, deverkregen resultaten en onderzoeksmoseliikheden voor de toekomst.ddirncnkiIbuOittIcIIIIll 0 l

Two DNA-binding proteins recognizing the apoVLDL-II gene cis-regulatory element D

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Dissertations of the University of Groningen

Proceedings - University of Groningen

NARCIS

Proceedings - University of Groningen

University of Groningen

Dissertations of the University of Groningen

ARTS repository - University of Groningen

ARTS repository - University of Groningen