Tese de doutoramento, Farmácia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2013Dynamics of the neutralizing antibody response and resulting HIV-2 escape during acute and chronic infections and their impact on viral evolution and disease progression remain unknown. The aims of this thesis were: characterize Nab response and molecular and phenotypic evolution of HIV-2 in early infection, investigate Nab responses in HIV-2 chronically infected patients with memory B cell imbalances and characterize the neutralization phenotype of HIV-2 X4-tropic isolates from diverse disease stages. Broad and potent Nabs are elicited very early in HIV-2 infection, the potency of this response being associated with high evolutionary rates. Nab escape was associated with R5-to-X4 switch, increased diversity in V1 and V3 regions and changes in V3 conformation. These findings show that Nabs are the main driver of the rapid molecular and phenotypic evolution of HIV-2 in early infection. Despite the loss of memory B cells observed with disease progression, broad and potent Nabs were elicited throughout HIV-2 infection. Nabs were found to target the C2V3C3 envelope region and, in advanced disease stage, the gp36 ectodomain. These data suggest a role for other B cell subsets in the production and perpetuation of Nabs. HIV-2 X4-tropic viruses were found to be significantly more Nab resistant than R5 viruses (independently of disease stage) and late infection X4 isolates were significantly more Nab resistant than early infection X4 viruses. X4-tropism was associated with sequence changes and significant gain in the V3 loop secondary structure. The results prove that Nab resistance is an intrinsic feature of X4-tropic HIV-2 isolates, acquired through infection period, and is associated with amino acid and conformational changes in the V3 loop that favour R5-to-X4 switch. In conclusion, Nab responses emerge very early in infection, persist despite memory B cells imbalances and drive tropism switch, supporting a major role for Nabs in HIV-2 evolution.O Vírus da Imunodeficiência Humana do tipo 2 (HIV-2) foi identificado pela primeira vez como agente causal da Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (SIDA) em 1986 numa colaboração entre cientistas e clínicos portugueses (Professora Maria Odette Santos Ferreira da Faculdade de Farmácia de Lisboa e Professor José Luís Champalimaud do Hospital Egas Moniz) e franceses (equipe de investigadores liderada pelo Professor Luc Montagnier do Instituto Pasteur em Paris).Embora este vírus seja semelhante ao HIV-1 em termos de organização estrutural e genómica, muitos aspectos distinguem as infecções provocadas por estes dois vírus. O HIV-2 é apenas responsável por pequenas epidemias nos países onde teve origem e em países vizinhos ou com relações históricas com estas regiões, em oposição ao HIV-1 que é responsável pela pandemia mundial. A maioria dos indivíduos infectados com HIV-2 apresenta cargas virais indetectáveis, contagem normais de células T CD4+ e ausência de progressão clínica. A resposta imunitária do hospedeiro ao HIV-2 também parece ser melhor comparativamente ao HIV-1, uma vez que a maioria dos indivíduos mantém fortes respostas celulares e humorais contra o vírus durante a fase crónica da infecção por HIV-2. Conhecer e compreender as interacções vírus-hospedeiro na infecção por HIV-2 poderá ser importante no desenho de vacinas, uma vez que as respostas imunitárias geradas contra o HIV-2 poderão ser mimetizadas na vacinação não só contra este vírus mas também contra o HIV-1. Uma das maiores diferenças entre as duas infecções é a produção de anticorpos neutralizantes de elevado espectro e potência nos indivíduos infectados por HIV-2. Estes anticorpos e outras respostas imunitárias poderão ser fundamentais no controlo da infecção e a base para a progressão mais lenta para SIDA observada nestes doentes. Contudo, muitos aspectos da infecção por HIV-2 permanecem por esclarecer, nomeadamente como é que os anticorpos neutralizantes controlam o vírus e como o vírus reage a estes anticorpos, em particular na infecção aguda. Perante este cenário, o objectivo geral desta tese foi conhecer melhor a resposta dos anticorpos neutralizantes na infecção por HIV-2 e explorar a forma como eles influenciam a evolução genética e fenotípica do vírus. A forma como o hospedeiro reage ao primeiro contacto com um agente infeccioso poderá ser determinante para o controlo e evolução da infecção. Desta forma, estudar a infecção primária por HIV-2 poderá elucidar sobre quais os mecanismos envolvidos no melhor controlo deste vírus comparativamente ao HIV-1. Uma vez que a maioria dos doentes infectados com HIV-2 são apenas diagnosticados na fase crónica da infecção, muito depois da seroconversão, torna-se extremamente difícil estudar a infecção aguda. Devido a este facto, ao contrário do que se passa na infecção por HIV-1, nada se sabe sobre a resposta imunitária e a evolução viral na infecção aguda por HIV-2. Esta lacuna no conhecimento sobre a infecção por HIV-2 levou ao primeiro objectivo desta dissertação: caracterizar a resposta em anticorpos neutralizantes e a evolução molecular e fenotípica do HIV-2 desde as fases iniciais e ao longo da infecção (capítulo 3). Estudar crianças infectadas por transmissão vertical constitui uma oportunidade única para conhecer a infecção aguda por HIV-2. Apesar de ser um evento raro, existem casos documentados de transmissão mãe-filho de HIV-2. Foram colhidas à nascença e ao longo de vários anos amostras de sangue de duas crianças nascidas de mães infectadas com HIV-2. A criança 1, nascida em 1998, foi diagnosticada com HIV-2, por PCR, aos 39 dias de vida e a criança 2, nascida em 1992, aos 27 dias de vida. A criança 1 nasceu com contagens de células T CD4+ normais e ausência de viremia, mas aos cinco anos de idade ocorreu um aumento drástico na carga viral em paralelo com o declínio das células T CD4+. Iniciou-se o tratamento, o que levou à recuperação virológica e imunológica. A criança 2 nasceu com encefalopatia apesar ter contagens de células T CD4+ normais e ausência de viremia. O tratamento foi iniciado de imediato, no entanto as opções terapêuticas existentes nessa altura (1992) eram muito limitadas. A carga viral aumentou e as células T CD4+ diminuíram, acabando a criança por falecer aos 9 anos. Foi extraído DNA de células de final de cultura de ambas as crianças de vários anos de infecção. O gene env foi amplificado, clonado e sequenciado. As sequências geradas foram analisadas em termos de diversidade genética, pressão selectiva, taxa de evolução nucleotídica e locais de glicosilação. Igualmente a partir das sequências geraram-se modelos estruturais da glicoproteina Env por homology modelling. Determinou-se o tropismo viral dos vírus de ambas as crianças à nascença e ao longo da infecção. Efectuaram-se ensaios de neutralização com os plasmas das crianças dos vários anos de infecção contra os seus vírus autólogos e, no caso da criança 1, também contra 5 vírus heterólogos, três R5 e dois X4. A diversidade nucleotídica e aminoacídica e os locais sobre selecção positiva foram significativamente maiores na criança 1 comparativamente à criança 2. Da mesma forma, a taxa de evolução viral na criança 1 foi quase o dobro da criança 2 e semelhante à taxa de evolução viral em indivíduos com infecção crónica por HIV-2 a fazerem tratamento antirretroviral, de onde se conclui que a rápida evolução molecular do HIV-2 começa logo no início da infecção. Ambas as crianças foram infectadas com vírus que utilizavam o coreceptor CCR5 (vírus R5) mas aos 5 anos de idade já possuíam vírus com tropismo para células exprimindo o co-receptor CXCR4 (vírus X4). Este foi o primeiro estudo em que se observou efectivamente uma alteração de tropismo R5 para X4 na infecção por HIV-2. De salientar que a transição de tropismo observada nestas crianças foi extremamente rápida, uma vez que vírus HIV-2 que utilizam o co-receptor X4 são geralmente encontrados em indivíduos infectados há vários anos e em fases avançadas da infecção. Desde o início de vida, a criança 1 apresentou uma forte resposta em anticorpos neutralizantes, tanto autóloga como heteróloga, particularmente contra vírus R5. A resposta contra vírus X4 foi significativamente mais fraca e diminuiu ao longo da infecção concomitantemente com o aparecimento das estirpes utilizadoras do co-receptor X4. A criança 2 desenvolveu uma resposta muito fraca contra vírus X4 autólogos, que decresceu rapidamente com a progressão da doença. Em ambas as crianças, a alteração no tropismo de R5 para X4, a diversificação das regiões V1 e V3 e a conversão da estrutura secundária da região V3 para conformação em β-hairpin foram associadas ao escape aos anticorpos neutralizantes. Os resultados indicam que na presença de uma forte resposta dos anticorpos neutralizantes (criança 1) a diversidade e a taxa de evolução viral são muito elevadas, ao passo que quando a pressão imposta pelos anticorpos neutralizantes é menor (criança 2) estes marcadores de evolução são semelhantes à infecção aguda por HIV-1 (tanto adultos como crianças). Concluindo, estes dados apoiam a hipótese de os anticorpos neutralizantes serem responsáveis pela rápida evolução molecular e fenotípica do HIV-2 logo no início da infecção. A produção de anticorpos neutralizantes está a cargo das células B. Após encontro com um antigénio, as células B naïve sofrem maturação e diferenciação em plasmócitos e células B de memória, capazes de produzir anticorpos específicos contra esse antigénio. Na infecção por HIV-1 e HIV-2 há diminuição acentuada do número de células B de memória. Esta depleção é irreversível mesmo com terapia antirretroviral. No entanto, e contrariamente à infecção por HIV-1, a maioria dos indivíduos infectados com HIV-2 produzem anticorpos neutralizantes durante a fase crónica da infecção. Qual será a relação entre as células B de memória e a produção de anticorpos neutralizantes na infecção por HIV-2? Conhecer, nesta infecção, qual a população de células B responsável pela produção dos elevados níveis de anticorpos neutralizantes poderá ser importante para a produção de uma vacina contra o HIV-1 e o HIV-2. Neste contexto, o segundo objectivo desta tese foi investigar a associação entre a resposta em anticorpos neutralizantes e as células B de memória na infecção por HIV-2 (capítulo 4). Foram estudados 37 indivíduos infectados com HIV-2, 73% dos quais nunca tinham recebido tratamento antiretroviral, 76% tinham carga viral indetectável e 59% tinham contagem de células T CD4+ igual ou superior a 350 células/μl. Os doentes apresentavam níveis variados de depleção das células B de memória sem alteração de classe (CD19+CD27+IgD+) e com alteração de classe (CD19+CD27+IgD-) directamente associada à diminuição do número de células T CD4+. Conhecia-se igualmente a resposta em anticorpos de ligação contra as regiões C2V3C3 e gp36 do invólucro. Os ensaios de neutralização foram efectuados com os plasmas dos indivíduos em estudo contra quatro vírus R5 heterólogos. Verificou-se que todos os doentes produziam anticorpos neutralizantes de elevada potência. Estes anticorpos eram também de largo espectro uma vez que, com duas excepções, todos os plasmas neutralizavam pelo menos dois vírus (55% neutralizavam três ou quatro vírus). O título de anticorpos neutralizantes não estava associado à contagem de células T CD4+, à carga viral ou ao tratamento antirretroviral. Contudo, o título de anticorpos neutralizantes estava associado ao nível de anticorpos de ligação contra a região C2V3C3 nos doentes com contagem de células T CD4+ ≥ a 350 células/μl, e aos anticorpos de ligação contra a região gp36 em doentes em estados mais avançados da doença (células T CD4+ < 350 células/ μl). Além disso, o título de anticorpos neutralizantes estava inversamente associado à depleção das células B de memória (sem e com alteração de classe) no grupo de doentes não tratados. Os resultados obtidos sugerem que, apesar da diminuição das células B de memória com a progressão da doença, continuam a ser produzidos anticorpos neutralizantes de elevado espectro e potência ao longo da infecção por HIV-2. Estudos recentes com o HIV-1 mostraram que, apesar de serem raros os doentes que produzem anticorpos neutralizantes, a produção de anticorpos não específicos é mantida pelos plasmócitos, que não necessitam de constante exposição ao antigénio para produzirem anticorpos. Os resultados apresentados nesta tese apontam para que outra população de células B (provavelmente os plasmócitos) seja responsável pela produção e perpetuação dos anticorpos na infecção por HIV-2, com a principal diferença, face ao HIV-1, destes serem neutralizantes. Estes anticorpos são maioritariamente dirigidos contra a região C2V3C3 e, em fases mais avançadas da infecção, contra a gp36. Estudos recentes verificaram que vírus HIV-2 com tropismo para células que expressam o coreceptor CXCR4, isolados de doentes a fases avançadas da infecção, são resistentes aos anticorpos neutralizantes. Foi também descrito no Capítulo 3 que vírus X4 isolados de crianças recentemente infectados são mais resistentes à neutralização. Estes resultados sugerem uma associação entre escape aos anticorpos neutralizantes e alteração de tropismo de R5 para X4. No entanto, permanece a dúvida se os vírus com tropismo para X4 são intrinsecamente resistentes à resposta em anticorpos neutralizantes. O terceiro objective deste trabalho foi caracterizar o fenótipo de neutralização de isolados primários utilizadores do coreceptor X4 isolados de doentes infectados com HIV-2 em várias fases da infecção de forma a determinar se todas as estirpes X4 são resistentes aos anticorpos neutralizantes independentemente do estadio da doença. Foram estudados cinco vírus X4 isolados de doentes em estados avançados de doença (mediana de células T CD4+=78 células/μl) e dois vírus X4 isolados de crianças infectadas por transmissão vertical (ver capítulo 3) em fase inicial da infecção (5 anos) (mediana de células T CD4+=320 células/μl). A sensibilidade dos vírus X4 à neutralização foi comparada com três vírus R5 usados como controlo (mediana de células T CD4+=275 células/μl). Os ensaios de neutralização foram efectuados contra 16 isolados clínicos heterólogos. Observou-se que os vírus X4 eram significativamente mais resistentes à neutralização que os vírus R5, independentemente da fase da infecção em que foram isolados. O facto de os vírus X4 das crianças serem também mais resistentes à neutralização que os vírus R5, demonstra que a resistência aos anticorpos neutralizantes pode surgir muito cedo após a transmissão. Além disso, os vírus X4 de indivíduos em estados avançados de doença eram significativamente mais resistentes aos anticorpos neutralizantes que os vírus X4 isolados das crianças (infecção recente), o que sugere que a resistência aos anticorpos neutralizantes é um processo gradual que vai ocorrendo ao longo da infecção. Ao analisar-se a região V3 dos vírus em estudo, detectou-se que todos os vírus X4 apresentavam as mutações nesta região anteriormente associadas a alteração de tropismo de R5 para X4 (uma mutação na posição 18, a mutação V19K/R, uma inserção na posição 24 e uma carga global igual ou superior a 7). A avaliação das estruturas secundárias desta região revelou igualmente diferenças importantes entre vírus R5 e X4. Os vírus R5 na infecção aguda e crónica são caracterizados por ausência de estrutura secundária regular, ao passo que os vírus X4 de infecção recente apresentam uma estrutura secundária em β-hairpin. Os vírus X4 de indivíduos em fase avançada caracterizam-se pelas conformações β-α-β ou helix-loophelix. Estes dados sugerem um modelo de evolução da estrutura secundária da região V3 no qual, ao longo da infecção, a pressão exercida pelos anticorpos neutralizantes sobre a V3 força o vírus a escapar e a alterar esta região de forma que deixe de ser reconhecida pelos anticorpos neutralizantes. Estas alterações favorecem igualmente a mudança de tropismo para X4 o que por sua vez está associado ao decréscimo das células T CD4+. Estes dados mostram que a resistência aos anticorpos neutralizantes é uma característica intrínseca dos vírus X4, provavelmente determinada por alterações na sequência e conformação da região V3, que dificultam o reconhecimento desta região pelos anticorpos. Em conclusão, este trabalho permitiu demonstrar que a resposta dos anticorpos neutralizantes surge muito cedo na infecção aguda e persiste na fase crónica da infecção mesmo após significativa depleção das células B de memória, e ainda que os Nabs são responsáveis pela evolução viral, por alterações estruturais na região V3 e pela alteração do tropismo que leva à resistência à neutralização. Os resultados constituem também um novo e potencialmente relevante contributo na área das vacinas. Em primeira análise, o escape à acção dos anticorpos neutralizantes existe na infecção por HIV-2 e por conseguinte uma vacina necessita de geral respostas contra estirpes R5 e X4. Os anticorpos são principalmente dirigidos contra a região V3 nas fases inicial e crónica da infecção. Em estádios mais avançados, a resposta contra esta região diminui mas surgem anticorpos cujo alvo é a gp36. Estes resultados confirmam que a V3 é um bom imunogénio a ser usado no desenho de vacinas mas salientam o facto de a gp36 poder conter epitopos importantes a serem incluídos numa vacina. Outra importante contribuição destes estudos foi a descoberta de que é possível manter uma forte resposta em anticorpos neutralizantes através de populações de células B que não as de memória, nomeadamente plasmócitos. Uma vacina contra o HIV-2 e o HIV-1 idealmente estimularia respostas deste tipo de células B. A dificuldade persiste em escolher o imunogénio ou grupo de imunogénios capazes de suscitar estas respostas. Destes estudos conclui-se que imunogénios baseados na região V3 e na gp36 do HIV-2 poderão ser bons candidatos para o desenho de vacinas.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/41328/2007
