高橋 啓太

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高橋, 啓太

タカハシ, ケイタ

Chuo University Academic Information Repository / 中央大学学術リポジトリ

  単細胞性緑藻Pseudococcomyxa ellipsoidea Obi株におけるTALEN法を利用した ADP-glucose pyrophosphorylase large subunit 遺伝子のノックアウト  TALEN-mediated knockout of gene encoding the large subunit of ADP-glucose pyrophosphorylase  in the green alga Pseudococcomyxa ellipsoidea strain Obi  生命科学専攻 高橋啓太  現在我々が使用している化石燃料は、将来的に有限なものであり、その使用に伴う二酸化炭素の排出は地球温 暖化に悪影響を及ぼしている。その為近年、持続可能な代替燃料の研究が盛んであるが、中でも注目されているのが微細藻類を用いた燃料生産である。その利点としては単位面積当たりのバイオマス生産性が高いこと、そして従来の穀物種を使ったバイオ燃料と異なり、食糧と競合しない点などが挙げられる[1]。 本研究室ではトレボキシア藻綱（Trebouxiophyceae）に属するPseudococcomyxa属を利用したバイオ燃料生産の実用化に向けた研究を行っている。Pseudococcomyxa属であるPseudococcomyxa ellipsoidea Obi株は、生育速度が速く、窒素栄養欠乏状態では乾燥重量当たり30 %程度の油脂を蓄積する[2]。実用化に際しては更なる油脂生産性の向上が課題の一つであり、本研究室では長年この課題に取り組んできた。本論文の研究はその一環として行われたものであり、新規の遺伝子改変法（Transcription activator-like effector nuclease（TALEN）法）を利用した、油脂生産性に優れた変異株の育種を目的としたものである。 植物や緑藻は、光合成で獲得した有機炭素をデンプンや油脂（主成分は triglyceride：TAG）という形態で貯蔵する。Chlamydomonas reinhardtiiやScenedesmus obliquusのデンプン合成遺伝子欠損株は、野生株に比べ油脂含量が増加することが知られている[3、4]。そこで本研究では、デンプン合成の初発酵素である Glucose-1-phosphate adenylyltransferase（別名：ADP glucose pyrophosphorylase（AGPase））の large subunitをコードする遺伝子（APL1）をTranscription activator-like effector nuclease （TALEN）法によりノックアウトし、ノックアウト株における油脂生産の増減を調べることを目的とした。 APL1配列を特異的に認識し切断する一対の人工ヌクレアーゼをコードするTALEN_L、及びTALEN_R遺伝子が導入された形質転換体である 7-18株が、著者の先行研究で既に得られていた[5]。しかし7-18株のAPL1遺伝子を増幅し、塩基配列を決めたところ、TALEN 標的部位に変異は認められなかった。Phaeodactylum tricornutumやArabidopsis thalianaにおけるTALEN法を利用した研究において、TALEN遺伝子を導入して得た株（第一世代）には標的遺伝子部位に変異が有る株と無い株が混在していた[6、7]。そしてそのTALEN遺伝子導入株の子孫が世代を経るにつれて、変異株の出現頻度は上昇した。このことから本研究においても7-18株の培養を重ねる事で APL1 変異株を取得することを試みた。そして 7-18 株を数十世代継代培養することにより、APL1遺伝子のTALEN標的部位に変異を持つ7-18派生株を3株（AG25株、AG125株、AG137株）分離することに成功した。AG25 株は 10 塩基対の欠失によるフレームシフト変異、AG125 株は 2塩基対の欠失に加え 3塩基対の挿入が起こったフレームシフト変異、そしてAG137株は3塩基対の挿入変異を、それぞれTALEN標的部位に有していた。これらの変異株のデンプン含有量はほとんどゼロであり、またその油脂生産量は10日目において、野生株に比べAG25株は 1.2倍、AG125株は 1.4倍、そしてAG137株は 1.4倍の増加を示した。したがって高油脂含有株の取得に成功し、当初の目標を達成した。また本研究は緑藻類において TALEN 法で遺伝子ノックアウト株を分離した最初の報告である。Pseudococcomyxa属にTALEN法を適用出来たことは、Chlorellaをはじめとする他のトレボキシア藻綱に属する微細藻類におけるゲノム編集技術の利用に弾みがつくと思われる。    参考文献 1. Stuart A Scott, Matthew P Davey, John S Dennis, Irmtraud Horst, Christopher J Howe,  David J Lea-Smith and Alison G Smith （2010）. Biodiesel from algae: challenges and prospects. Current Opinion in Biotechnology, 21:277–286 2. Akira SATOH, Misako KATO, Katsuyuki YAMATO, Mizuki ISHIBASHI, Hiroshi SEKIGUCHI, Norihide KURANO, Shigetoh MIYACHI（2010）. Characterization of the Lipid Accumulation in a New Microalgal Species, Pseudochoricystis ellipsoidea （Trebouxiophyceae）. Journal of the Japan Institute of Energy, 89, 909-913. 3. Yantao Li, DanxiangHan, GuongrongHu, DavidDauvillee, MiltonSommerfeld, Steven Ball, QiangHua（ 2010） . Chlamydomonas starchless mutant defective in ADP-glucose pyrophosphorylase hyper-accumulates triacylglycerol. Metabolic Engineering 12 387–391 4. Lenny de Jaeger, Ruben EM Verbeek, René B Draaisma, Dirk E Martens, Jan Springer, Gerrit Eggink and René H Wijffels（2014）. Superior triacylglycerol （TAG） accumulation in starchless mutants of Scenedesmus obliquus: （I）mutant generation and characterization. Biotechnology for Biofuels 7:69 5. 高橋啓太（2014）. Pseudococcomyxa ellipsoidea におけるデンプン合成に関わる遺伝子のノックアウト 。 中央大学 理工学部 生命科学科 卒業研究論文 6. Fayza Daboussi, Sophie Leduc, Alan Mare´chal, Gwendoline Dubois, Vale´rie Guyot, Christophe Perez-Michaut, Alberto Amato, Angela Falciatore, Alexandre Juillerat, Marine Beurdeley, Daniel F. Voytas, Laurent Cavarec & Philippe Duchateau（2014）. Genome engineering empowers the diatom Phaeodactylum tricornutum for biotechnology. NATURE COMMUNICATIONS 7. Joachim Forner, Anne Pfeiffer, Tobias Langenecker, Pablo Manavella, Jan U. Lohmann（2015）. Germline-Transmitted Genome Editing in Arabidopsis thaliana Using TAL-Effector-Nucleases. PLOS ONE  

TALEN-mediated genome editing of gene encoding ADP-glucose pyrophosphorylase large subunit in green alga Pseudococcomyxa ellipsoidea strain Obi

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