Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas.
Abstract
El estradiol 17ß-D-glucurónido (E17G) induce colestasis aguda en la rata con
internalización endocítica de los transportadores canaliculares, Abcb11 y Abcc2. Las
vías de señalización de la proteína quinasa clásica (PKCc) y las vías de señalización de
PI3K juegan roles complementarios en la colestasis por E17G, también se ha reportado
la participación de la vía GPR30/AC/PKA. Ya que el estradiol no conjugado es capaz
de activar estas vías de señalización a través de la activación del receptor de estrógeno
alfa (REα), en este trabajo de Tesis se postula como hipótesis la participación de REα en
las manifestaciones colestásicas del E17G en el modelo de Hígado Aislado y Perfundido
de rata (HAPR) como así también en modelos de cultivos primario de hepatocitos de
rata. En el modelo de HAPR y en cultivo primario de hepatocitos, el E17G activó el
REα. En HAPR, E17G disminuyó el flujo biliar y las excreciones de dinitrofenilglutation,
y taurocolato (sustratos específicos de Abcc2 y Abcb11, respectivamente) en
aproximadamente 60 %; la pre-administración de ICI (inhibidor de REα) previno en
forma casi completa estas disminuciones. En el modelo de duplas aisladas de
hepatocitos de rata (DAHR), un modelo polarizado de hepatocitos en cultivo, el
tratamiento con E17G disminuyó la acumulación vacuolar canalicular de colil-glicilamido
fluoresceína (sustrato de Abcb11) con un CI50 de 91±1 μM. El tratamiento con
ICI aumentó la CI50 a 102±1 μM, y similarmente previno la disminución de la
acumulación vacuolar canalicular del sustrato de Abcc2, glutatión-metil fluoresceína,
con una CI50 de 104±1μM sin ICI y un CI50 de 164±2 μM en presencia del inhibidor.
El inhibidor ICI también previno completamente la internalización endocítica de los
transportadores canaliculares Abcb11 y Abcc2.
La participación de REα se confirmó a través del uso de knock-down del REα en
cultivo primario de hepatocitos en configuración “sándwich” (HRCS) donde se observó
que la disminución de la expresión de REα previno la internalización de ambos
transportadores cuando las células fueron tratadas con E17G.
En el modelo de DAHR, la protección de ICI tuvo un efecto sumatorio cuando fue
probado conjuntamente con Wortmanina, un inhibidor de PI3K pero no se observó un
efecto sumatorio con el inhibidor Gö6976, un inhibidor de PKCc; sugiriendo que REα
forma parte de la vía de señalización de PKCc pero no de la vía de señalización de
PI3K. Un análisis más detallado de las activaciones REα y PKCc inducida por E17G,
demostró que ICI no afecta a la activación PKCc mientras que Gö6976 impidió la
activación de REα, lo que indica que la activación de PKCc (evaluada a través de la
activación de PKCα) precede a la activación de REα. Por otro lado, también se observó
mediante la técnica de western blot en cultivo primario de hepatocitos que la activación
de REα ocurriría independientemente de la vía GPR30/AC/PKA y que probablemente la
fosforilación de sustratos de PKA (o su mantenimiento en estado fosforilado) depende
de la activación de REα.
Conclusión: el REα está implicado en la falla secretora biliar inducida por E17G y su
activación ocurre luego de la activación de PKCc. REα activado participaría en cascadas
de señalización que conducen a la desinserción como por ejemplo las derivadas de la
activación de PKA.Fil: Barosso, Ismael R. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental (IFISE-CONICET); Argentina
