Endo, Yasumasa

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千氏 名学 位専門分野の名称学 位 授 与 番 号学位授与の 日付学位授与の要 件学 位 論 文 題 目遠健 康正伸士歯学r･.lJu平第4717号平成25年3月25日医幽輩学総合研究科社会環境生命科学専攻(学位規則 (文部省令)第4粂第 1項該当)Preventiveefectsoftlehaloseonosteoclastdiferentiationinratperiodontitismodel(ラット歯周炎モデルにおける､ トレハロ-スの破骨細胞分化抑制作用)学位論文審査委員 商柴 正悟 教授 大原 直也 教授森凹 学 教授学位論文内容の要旨【緒言】歯周炎は､歯肉の炎症及び歯槽骨吸収を伴う慢性炎症性疾患である｡骨吸収にn;tcvjle毒.芋蔓=C;r;琶 2B.TAaAdKnfGSTE挽 琵 嘉破朋 IM包前駆細胞表面に存在する recep(oractivatorofnuclearfactorkappaB(RANK)と結合し､破骨細胞の分化を引き起こす｡RANKL産生を促進する因子のす詣 森脇 oga?maah;r'iLde*=f(kp3)i浩 慧 惣 t.L,P亨足RFF.牒 驚 譜TLR4が括性化すると､その下位に存在する myeloid differentiation factor88(LJMKD38,i,露 0(I;iKnCftnEsKe,FfCd)pT=ctグ芋Irva;SlBu鮎 IAn.alxgNukaLebd.蓑 scW bR賢)したがって､LPSとTLR4の結合を阻害できれば､PKC/ERK経路によるRANKL産生が抑制され､結果として破骨細胞の分化が抑えられると期待される0トレハロースは､グルコース2分子がa-I,1結合した二糖類であるO近年､ トレハロースには､病的な骨吸収を抑制する効果があることが示唆されているOしかし､トレハロースが､歯肉の炎症組織において､LPSとTLR4との結合やそれに伴うRANKLの産生にどのような効果を示すのかは不明である0本研究では､ラット歯周炎モデルを用いて､トレハロースの破骨細胞分化に与える影響を､組織学的､生化学的に検討した｡【方法】wistar系雄性ラット24匹を6匹ずつ､ ① 対照群 Potreatment:NT群)､ ②③ 30mg/mlトレハロース塗布押 (T30群)､および④ 60mg/ml秤 (T60押)の4群に分けたo実験期間笹2嘩間とL,ちDNT群t.羊対VehicJe# (Vトレハロース%.'h･しては､通常飼育のみを行らたo他の3畔では､上顎両側第二臼歯歯頚部に綿糸を結-A,i-kL､実政的歯周炎を恕起させたo結数の翌日から､これら3群のラットの伸肉桃に､ 春樹水 Ⅳ群)､ 30mg/mlトレハロース水溶液 (T30群)､ もしくは60n一g/mlトレハロース水杯液(T60押)を1日1回､週5回の頻度でそれぞれ塗布した01回の処lTcにつき､5plを 5分間隔で計3回塗,和したo塗布後は乾燥綿球にて余剰の溶織を除去した｡実験殉慨終了後､上顎右側歯周組縦の組織標本を作製し､-マ トキシリンーエオジン地色を行い､歯肉結合組織中の多核好中球数を計測した｡また､RANKL免疫敗色及びTRAP染色を行い､歯槽甘表面のRANKL陽性細胞数､TRAP陽性破嘗甥 賢 雷獣 巌 諾 ､IL諾 ㌫ 農謎 等禦 ,=書望見翠莞抽出したO遺伝子発現の分析には逆転写リア/レタイムPCR法を用い､tumornecrosisfTactor(TNF)-α､RANKL､TLR4の発現量を求めたOタンパク発現の分析にはウエスタンプロット法を用い､TLR4､ン酸化ERK(p-ERK)の発現量謂 Db8是,DE,;鮎 左;rTlEaKIC_jn%Po,K鮎 詣 こ是一元配置分散分析とTukey法を､タンパク分析についてはl検定をそれぞれ用い､群間比較を行った｡【結果】Ⅴ群の歯周組織では､ 多核好中球数､ RANKL陽性細胞数､ およびTRAP陽性破竹細胞牧がNT群よりも有意に多かった｡一方､T30畔とT60群の多核好中球数､RANKL陽性細胞数､および TRAP陽性破骨細胞牧は､いずれもV群と比べて有意に少ない値を示した｡T30群とT60群との問に有意差は認められなかった｡また､歯肉のIipidAの発現は､NT群ではほとんど認められず､V群､T60群では同程度認められた｡TNF-α､TLR4､RANKLの遺伝子発現の大きさは､V群ではNT群と比較して有意に高かったが､T60群ではV群よりも有意に低かったoT60群におけるTLR4､MyD88､p-PKC､p-ERKのタンパク発現量はV群と比べて少なかった｡ PKC､ERKの発現量は2群間で有意差は認められなかった｡【考察】過去の研究では､ラット臼歯歯頚部に絹糸を結数することで実験的齢周炎が惹起されることが示されている｡本研究においても､V蛸の多綾好中球数とTRAP陽性破骨細胞数がNT群と比較して有意に多かったという結果が得られ､絹糸結染により実験的歯周炎が惹起されたことが示された｡このような歯周炎誘碓状態において トレハロースを塗布することにより歯肉の多核好中球数や歯槽骨表面のTRAP陽性破骨細胞数が減少したoさらに､歯肉におけるRANKL発現もトレハロースにより抑制された｡これらの結果から､トレハロース塗布により歯肉の炎症及び破骨細胞分化が抑1-.･uされたことが示唆された｡ラット白糖に絹糸を結染することで､歯肉溝-の細菌の凝集を引き起こす｡今回のモデルにおいても､LPSは絹糸結数モデル(V群)の歯肉で増加したoLかし､トレハロースの塗布により歯肉におけるlipidAの発現は抑制されなかった(T60琵転ii;pL,idSAis,LiPbS,禁 誓㌫諾tLTi誓 妄誓 吾柔毛tJス忘㌫ GチLTPLSRaE.蓋タンパク及び遺伝子発現は減少した｡過去の報告では､トレハロースは細胞膜の構造を安定化させることが示されているOゆえに､ トレハロースはTLR4の発現を抑制し､口腔内細菌から産生されたLPSとTLR4との結合の頻度を減少させたことが示唆されるoMyD88は､PKC/ERK経路のみではなく､炎症性サイ トカイン産生も促進することが報告されているO今回､トレハロースはTNF-αの遺伝子発現を抑制した.1NF-αは直接的及び間接的に破骨細胞の分化を促進するOしたがって､ トレハロースによる破骨細胞分化抑制作用においては､PKC侶RK経路の不活性化に加えて炎症性サイ トカインの抑制も一役を担っている可能性がある｡本研究では破骨細胞の分化について分析したが､実際の骨吸収の程度については分析していない Oまた､今回の実験期間は2週間という短期間であった｡今後は､より長期間にわたる実験を実施し､実際にトレハロースに骨吸収を抑制する効果があるか否かを検討する必要がある｡1【結論】ラット歯周炎モデルにおいて､トレハロースには､TLR4およびPKC侶RK経路を不活性化し､破骨細胞の分化を抑制する作用があることが示唆された｡こ:学位論文審査結果の要旨近年, トレハロースには病的な骨吸収を抑制する効果があることが示唆されている｡しかし,トレハロースが,歯肉の炎症組織において,lipopolysaccharjde(LPS)とtol1-likereceptor(TLR)4との結合やそれに伴うreceptol･aCtivatorornuclearfactorkappa-Bligand(RANKL)の産生にどのような効果を示すのかは不明である｡本研究では,ラット歯周炎モデルを用いて,トレハロースの破骨細胞分化に与える影守･Lrl.tを,組織学的,生化学的に検討した｡Wistar系雄性ラット24匹を6匹ずつ,対照群 (Notreatment:NT群),溶媒の蒸留水を用いたvehicle群 (V群),30mg/mlトレ-ロース水溶液塗布群 (T30群),および60mg/mlトレ-ロース水溶液塗布群 (T60群)の4群に分けた｡NT群は通常飼育のみを行った｡他の3群では,上顎両側第二臼歯の歯肉溝に絹糸を結繁し,実験的歯周炎を惹起させた｡結敦の翌日から,これら3群のラットの歯肉溝に,それぞれの水溶液を1日1回 (1回の処置につき5トJを5分ごとに3回塗布),週5日の頻度で塗布した｡その結果,V群の歯周組織では, 多核白血球数, RANKL陽性細胞数, およびTRAP陽性破骨細胞数が,NT群よりも有意に多かった｡一方,T30群とT60群では,これらの細胞数は,いずれもV群よりも有意に少なかったD T30群とT60群との間に有意差はなかった｡Tnf-a,Tlr4,そしてRanklの発現程度は,V群ではNT群と比較して有意に高く,T60群では V群よりも有意に低かった｡ T60群における TLR4, myeloiddiferentiationfactor88(MyD88), phosphorylatedproteinkinaseC (p-PKC),そしてphosphorylatedextracelularsignal-regulatedkinase(p-ERR)の発現量は,V群と比べて少なかった｡PKCとERKの発現量は,T60群とV群との間で有意差はなかった｡以上のことから,ラット歯周炎モデルにおいて,トレハロースは破骨細胞の分化を抑制し,その機序としてPKC/ERK経路の活性化抑制が関与することを示唆した｡本論文は,ラット実験的歯周炎における破骨細胞分化及びその機序の一部に対するトレハロース塗布の有効性を解明する上で重要な知見である｡よって,論文審査担当者は一致して,本論文に博士 (歯学)の学位論文としての価値を認める｡

ラット歯周炎モデルにおける、トレハロースの破骨細胞分化抑制作用

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