Yamada, Kaoru

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GGT1欠損モデルとしてのDWGマウスを用いた生殖機能におけるGGT1の役割に関する研究

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 氏 名 授与した学位 専攻分野の名称 学位授与番号 学位授与の日付 学位授与の要件  学位論文の題目  論文審査委員 山田 郁 博 士 農 学 博甲第４７８４号 平成２５年 ３月２５日 自然科学研究科 バイオサイエンス専攻 （学位規則第５条第１項該当） GGT1 欠損モデルとしての DWG マウスを用いた生殖機能における GGT1 の役割に関する研究 准教授 辻  岳人  教授 国枝 哲夫  教授 舟橋 弘晃  学位論文内容の要旨  dwarf gray (DWG)マウスは，常染色体劣性遺伝の突然変異である dwg をもち，dwg/dwg 個体において矮小・白内障を呈している。これまでの解析によりdwg/dwg個体では，グルタチオン(GSH)の代謝に重要な酵素であるγ-glutamyl transferase1 (GGT1)をコードする Ggt1 遺伝子上に 13 塩基の欠損が存在すること，さらにこの欠損によりスプライシング異常が生じることを明らかにしている。一方，dwg/dwg 個体における GGT 活性の有無と GGT 活性の欠損により生じる GSH 濃度の変化が起きているかは不明であり，dwg/dwg 個体の表現型異常が Ggt1 遺伝子の変異に起因すると決定するには更なる解析が必要である。さらに dwg/dwg 個体は雌雄共に不妊であるとの報告があるがその詳細な解析はされておらず，不妊の程度や原因は不明である。そこで本研究では，dwg/dwg 個体の表現型異常と Ggt1 遺伝子の突然変異との関連性を調べるとともに，dwg/dwg 個体においても不妊を呈しているかを調べ生殖制御機構における GGT1 の機能の検討を試みた。 dwg/dwg 個体において GGT1 が機能しているかを調べるために，腎臓の GGT 活性を調べたところ，野生型個体の 4.0％程度の活性しか示さなかった。また，血漿，腎臓，肝臓，眼球における GSH 濃度を測定したところ，dwg/dwg 個体では血漿中および腎臓中の GSH 濃度が増加し，肝臓および眼球の GSH 濃度が減少していた。そこで，dwg/dwg 個体に NACを投与したところ矮小・白内障が改善した。以上の結果から，dwg/dwg 個体では GGT1 が正常に機能しないために細胞中の GSH もしくはシステイン濃度が低下し，矮小や白内障を呈しており，DWG マウスの表現型異常は Ggt1 遺伝子における突然変異による GGT1 タンパクの機能低下が原因であることが示された。 dwg/dwg 個体の雌雄どちらとも正常個体と 3 か月以上同居させても産仔が得られず，雌雄共に不妊であることが確認された。さらに不妊の原因を明らかにするために，dwg/dwg 個体の生殖器の重量測定および組織学的解析を行ったところ，雄では精巣上体および精嚢の重量が低下しており，精巣および精巣上体において精子形成が進行し，精巣上体管内に精子が存在するが，精嚢内の分泌物が蓄積していないことが明らかとなった。雌では性周期が発情休止期で停止しており，卵巣および子宮のどちらも重量が減少し，卵巣では胞状卵胞は存在するが黄体は存在しなかった。一方，dwg/dwg 個体由来の精子および卵子を用いて体外受精を行ったところ，受精し胚盤胞期胚まで発生が進行したため，配偶子機能に不妊の原因となる異常はないことが明らかとなった。dwg/dwg 個体の生殖器官における異常はインスリン様成長因子 1(IGF-1)ノックアウトマウスと類似しており，GSH を投与すると血漿中の IGF-1 濃度が上昇することが報告されていることから，IGF-1の分泌調節に GGT が関与することが予想された。そこで dwg/dwg 雄個体の血漿中の IGF-1 濃度を測定したところ，野生型個体の 24.2%しか存在していなかったため，不妊の原因として IGF-1 濃度の低下による副生殖器の異常が考えられた。本研究の結果から GGT1 は GSH 濃度の調節を介して血中の IGF-1 上昇をもたらす経路に関与することで，雌雄の正常な生殖組織機能の維持に貢献していることが考えられた。今後，生殖制御機構における GGT1 の役割を詳細に解明するうえで，DWG マウスは GGT1 欠損モデルとして有用であると考える。 論文審査結果の要旨  本論文は，グルタチオン(GSH)の代謝に関わるγ-glutamyl transferase1 (GGT1)に注目し，Ggt1 遺伝子に突然変異(dwg)をもつ dwarf gray (DWG)マウスのGGT1欠損モデルとしての有用性とGGT1による生殖機能制御に関わる分子機構を明らかにすることを目的とした研究であり，その内容は以下の通りである。 まず，dwg による GGT1 機能への影響を調べるために，dwg/dwg 個体の腎臓における GGT 活性を調べたところ，野生型個体の 4.0％程度の活性しか示さなかった。また，dwg/dwg 個体では血漿中および腎臓中の GSH濃度が増加し，肝臓および眼球の GSH 濃度が減少していた。さらに，dwg/dwg 個体に N-Acetyl-L-cysteine を投与したところ矮小・白内障が改善した。以上の結果から，dwg/dwg 個体では GGT1 が正常に機能しないことで細胞中の GSH もしくはシステイン濃度低下が，DWG マウスの表現型異常の原因であると結論づけている。さらに，dwg/dwg 個体の生殖器の重量および組織学的解析を行ったところ，雄では精嚢の重量が低下し，精嚢内の分泌物が蓄積していないこと，雌では性周期の異常が観察され，卵巣および子宮の重量が減少するとともに，卵巣では胞状卵胞は存在するが黄体は存在しないことを確認した。一方，dwg/dwg 個体由来の精子および卵子を用いて体外受精を行い，配偶子機能に不妊の原因となる異常はないことを確認した。観察された dwg/dwg 個体の生殖器官における異常はインスリン様成長因子 1(IGF-1)ノックアウトマウスと類似していることから，dwg/dwg 雄個体の血漿中の IGF-1 濃度を測定したところ，野生型個体の 24.2%しか存在していなかった。これらの結果から，GGT1 は GSH 濃度の調節を介して血中の IGF-1 上昇をもたらす経路に関与することで，雌雄の正常な生殖組織機能の維持に貢献していると結論づけている。 これらの成果は，GGT1 の新たな機能を示す内容であり，哺乳類の生殖機能制御機構の解明に向けた重要な知見である。これらの成果は本論文で的確にまとめらており，また，国際学術誌に英語論文としても発表されている。したがって，本学位審査会において，山田郁氏により提出された本論文は，博士学位（農学）に値するものと判断した。

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