Huisman, Christian

English

De epigenetische componenten van een gen, waarvan DNA methylatie en histonmodificaties het belangrijkste zijn, hebben een belangrijke rol bij de regulatie van genexpressie. Deregulatie van de epigenetische informatie kan er toe leiden dat genen afwijkend tot expressie komen, wat vervolgens tot ziekte kan leiden. Een bekend voorbeeld is In kanker, waar afwijkende DNA- en histonmethylatie patronen op bepaalde genen geassocieerd is met ongeremde celgroei. Het doel van dit onderzoek was om genen blijvend aan- of uit te zetten door epigenetische foutjes op genen te repareren. Hierdoor wordt als het ware de epigenetica van een genen geherprogrammeerd, waardoor er ‘permanente’ verandering van genexpressie mogelijk worden. Het genspecifiek overschrijven van de epigenetica kan gedaan worden door epigenetische enzymen te targetten naar genen die afwijkend tot expressie komen mbv zinkvingers. Zinkvingers kunnen worden gericht naar bijna iedere gewenste plek in het genoom. We hebben ~35 zinkvingers ge-engineerd, en gevalideerd voor hun genregulatie capaciteit mbv de vaak gebruikte transcriptieregulatoren VP64 en SKD. Vervolgens laten we zien dat gehypermethyleerde tumorsuppressorgenen in baarmoederhalskanker ge-activeerd en gedemethyleerd kunnnen worden met zinkvingers gelinkt aan VP64 of een demethylerend enzym, wat vervolgens resulteerde in verminderede celgroei. Ook konden we op eenzelfde soort manier borstkankercellen minder hard laten groeien door het oncogen Her2/neu uit te zetten door het lokaal methyleren van histonen. In fibroblasten hebben we laten we zien dat het pro-fibrotisch PLOD2 gen efficiënt uitgezet kan worden door zijn promoter te methyleren. Verder onderzoekt deze thesis de specificiteit van zinkvingers als targeting tool. De methodes voor het reprogrammeren van de epigenetische code van target genen is in principe bruikbaar om de expressie van elk gen in het menselijke genoom te moduleren en dus controle te krijgen over het hele genoom om ziekte te bestrijden.The reversible nature of epi-mutations, such as DNA hypermethylation and histone modifications, is extensively explored as therapeutic target for gene expression modulation in several diseases. One of the best examples is the DNA hypermethylation of silenced tumor suppressor genes (TSGs) in cancer, which is the target of a variety of therapeutic approaches. However, these approaches act genome-wide. This thesis explores the potencies of epigenetic reprogramming of single genes to normalize their expression levels. Such reprogramming can be achieved by targeting epigenetic enzymes (DNA/histone modifiers) to promoter regions of mis-expressed genes by fusion to engineered zinc fingers proteins (ZFPs). ZFPs can be designed to target virtually any gene in the genome. A total of ~35 ZFPs were engineered and validated for gene regulatory capacity by fusions to transcriptional effectors (VP64/SKD). This thesis demonstrated that hypermethylated candidate TSGs in cervical cancer can be efficiently re-expressed and demethylated by ZFPs linked to VP64 or Tet2, resulting in tumor growth inhibition. Similarly, such decrease in cell growth was achieved in breast cancer cells after downregulation of oncogene Her2/neu by repressive histone modifiers. In fibroblasts, we showed efficient downregulation of gene expression by targeting a DNA methylating enzyme to pro-fibrotic PLOD2. Furthermore, this thesis demonstrates the binding of ZFPs to their intended sequence and throughout the genome. In conclusion, our approach has the potency to regain control over the transcriptome in disease. Besides the observed beneficial functional effects, we could overwrite epigenetic signatures, as a powerful approach to permanently change gene-expression levels

Dissertations of the University of Groningen

Epigenetic reprogramming of endogenous genes for permanent modulation of gene expression:Targeted interventions by self-engineered zinc finger proteins

https://pure.rug.nl/ws/files/20315578/Chapter_2_.pdf

Epigenetic reprogramming of endogenous genes for permanent modulation of gene expression:Targeted interventions by self-engineered zinc finger proteins

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Dissertations of the University of Groningen