伊藤 正裕

内藤 宗和

寺山 隼人

内藤, 宗和

寺山, 隼人

伊藤, 正裕

Tokyo Medical University Institutional Repository / 東京医科大学学術情報リポジトリ

一　88　一シンポジウム1．同系精巣細胞の皮下注射のみによって誘導　　するマウス実験的アレルギー性精巣炎の微　　小組織環境Tissue　microcircumstance　of　experimental　allergicorchitis　induced　by　immunization　with　viablesyngeneic　testicular　germ　cells　in　mice（解剖学第一講座）○内藤　宗和、寺山　隼人、伊藤　正裕Abstract　Speimatozoa　do　not　appear　in　the　seminiferous　epith－elium　until　puberty，　when　immune　tolerance　has　alreadybeen　established．　Therefore，　they　contain　variousautoimmunogenic　materials，　which　are　recognized　asforeign　by　the　self　immune　system．　However，　theblood－testis－barrier　formed　by　Sertoli　cells　and　theblood－epididymal　barrier　formed　by　epididymal　epith－elial　cells　protect　autoimmunogeneic　spermatozoa　fromattack　by　the　self　immune　system．　We　previously　estab－lished　that　subcutaneous　two　injections　of　viablesyngeneic　testicular　germ　cells　（from　spermatogonia　totesticular　spermatozoa）　induce　experimental　autoim－mune　orchitis　（EAO）　with　no　involvement　ofepididymo－vasitis　in　mice．　ln　the　present　study，　weinvestigate　tissue　microcircumstance　during　EAO　usingTEM，　real－time　PCR　and　ELISA．　ln　normal　mice，lymphocytes　were　never　found　inside　the　seminiferoustubules，　however，　a　few　lymphocytes　could　be　occasion－ally　observed　in　epithelial　layer　of　the　tubuli　recti　andthe　adj　acent　rete　testis．　ln　early　stage　of　EAO，　somelymphocytes　first　accumulated　around　the　tubuli　rectiand　then　migrated　into　the　myoid　layer　of　them　beforespreading　to　the　seminiferous　tubules．　During　thelymphocytic　infiltration，　Sertoli　cells　lining　the　tubulirecti　underwent　degeneration．　This　suggests　thatlymphocytes　can　gain　access　to　TGC　autoantigens　at　andaround　the　tubuli　recti　under　both　normal　and　patholog－ical　conditions．　Cytokines　examination　revealed　thatproduction　of　IL－la，　IL－2，　IL－6，　IL－10，　TN　F－cr　andIFN－7　had　increased　in　the　immunized　mice．　We　alsofound　that　in　vivo　treatment　with　IL－6　or　anti－IFN－7mAb　had　prevented　EAO　however　that　with　I　L－10　hadaugmented　EAO．1．はじめに　実験的アレルギー性精巣炎（Experimental　allergicorchitis＝EAO）は精巣抗原に対する自己免疫により、精巣へのリンパ球浸潤と造精障害を引き起こす免疫性ヒト男性不妊のひとつの疾患モデルである。男性の生殖細胞系は精祖細胞・精母細胞・精子細胞・精子の一連の細胞群であるが、精子細胞と精子は免疫系の発達よりはるかにおくれて分化成熟してくるために、精子抗原が自身の免疫系により異物として認識されてしまう。しかし精子・精子細胞は精細管の内記に存在し、Sertoli細胞で構成される精巣一血液関門（blood－testis　barrier）にて隔絶されているため生理的に護られていると考えられている。　以前より精巣をホモジネートした自己抗原の皮下注射により抗精子抗体の産生など自己免疫反応が生じるのは知られていたが、それだけでは精巣の免疫学的に保護されている環境を打ち破ることができないため、マウスにおいては精巣ホモジネートにアジュバンドを混ぜEAOを誘導する従来の方法があった。しかし、これらアジュバンド処置は免疫反応を高めるだけでなく、非特異的に精巣一血液関門を破壊し精子・精巣細胞抗原のみならず、精油細胞、精母細胞、Sertoli細胞、Leydig細胞や精細管基底膜などに対する自己免疫応答までが誘導されるというかなり人工的な疾患モデルという要素があった1“3）。我々は同系マウスから採取したtesticular　germ　cells（TGC）の皮下注射を14日間隔で2回行うだけで、アジュバンドなどを使うことなく、高頻度にEAOが誘導可能であることを見出した4）。またこのEAOモデルのリンパ球を正常マウスに移入する実験を行ったところ、CD8十T細胞あるいはB細胞ではなく、CD4＋T細胞がレシピエントマウスにEAOを引き起こすことを認めたので、　CD4十T細胞主体の疾患であることが考えられている5）。このEAOのリンパ球浸潤は精巣輸出管、精巣上体、精管には浸潤せず、直精細管から始まり、病変の進行とともに精細管全体に広がった（図1）。（7）2006年1月　！　．tサ．一　’f／7／／・　F／　iS17！！　〈iri：ノ・li二1第156回医学会総会演題抄録」　VE．触轍轍触働、鰯幣蜘RT　－ktsγ織・　飾殉勘轍鱒鞠●＄T　IL－1　a　（pg／ml）ig　illlilEli，・一一ut・．　Control　EAO　　IL－6　（pstml）300200　　　　馨’0X kt，r一一’iio　ww　Control　EAO一　89　一　lL－2　（unitノ「ml｝　　　　　　　　　　　IL－4　（P9／ml）　Control　　EAO　Contro　l　　EAO　IL－10（unitんD　　　　　　IF閥一γ（P9んD　Control　　　EAO　Control　　　EAO図2Cytokines　production　by　spleen　cells　of　EAO－sensitized　　mlce　　　　　　　　　嚇噸犠噸陵　　　　　　　　　　働、・㌦。辮　　　　　　　　　　　　　　㌦触・…．。。伽　　　　　　　　　　　　　　　　　　臓鞠覇墜図1Anatomy　of　the　testis．　At　each　end　of　the　semin漉rous　　tubule　（ST），　where　they　open　into　the　rete　testis　（RT），　　there　is　a　transitional　zone　that　is　called　the　tubuli　recti　　（TR）．　Arrows　indicate　the　direction　of　lymphocytic　　infiltration　in　EAO．　DE，　Ductuli　efferentes．　今回、直精細管とその周辺の免疫学的な組織環境を調べるために正常のマウスと初期EAOのマウスの微細構造変化を観察し、また病変の進展に関わると考えられる各種サイトカインの動態を調べた。さらに、EAOモデルマウスにサイトカイン療法を試みたので以下にその概要を述べる。2．実験系　雄C3He／Heマウスに生きた同系TGC（1×107個）の皮下注射を14日間隔で2回行いEAOを誘導した。正常と初期EAOマウス（28日目）の精巣を特に直精細管とその周辺に注目し透過型電子顕微鏡にて観察した。次にTGC感作2回目以降のEAOマウスの脾臓におけるサイトカイン（IL－1α，　IL－2，　IL－4，　IL－6，　ILIO，IFN一γ）の分泌および、精巣におけるサイトカイン（IL－1β，　IL－2，　IL－6，　IL－10，　TNF一α，　IFN一γ）に対応するmRNAの発現量をそれぞれELISA法およびRT－PCR法を用いて定量した。またその結果をもとにEAOマウスにサイトカイン療法（IFN一γ抗体、　recom－binant　IL－6、　recombinant　IL－10）を試みた。　透過型電子顕微鏡像　正常像：直精細管の上皮細胞に変性した精子細胞の貧食が常に認められ、その近傍に上皮細胞の基底膜を越えて潜り込むマクロファージを数個認めた。また、基底膜を貫いて上皮細胞に直接接触するリンパ球も数個認め、管腔内で変性した精子細胞に近接してい｝LmlB　（Ratio＞ IL－2　（Rstio）1：紐－：；躍謹Centrol　EAO　IL－10　（ketio）’i　M　Control　EAOControt　EAO　TNF－a　（Ratio＞1雛　12　pi，lI・・見・…　Control　EAO21IL－6　（Ratio）　　　z江lo　Centrol　EAO　tFN一　r　〈kotio）葦lE，iJ灘　齢し　Contret　EAO図3mRNA　expressions　of　cytokines　in　testes　of　EAO－sensit一ized　miceた。このような所見は精細管では一切観察されなかった。　初期EAO像：直精細管に近接する間質のLeydig細胞群に入り込むように多くのBおよびTリンパ球の浸潤を認めた。Tリンパ球の一部は、破壊された直精細管の基底膜を越え、直精細管の上皮細胞に向かって浸潤していた。周囲の間質にリンパ球浸潤を認めた直精細管の上皮細胞は直接のリンパ球の侵入なしに変性し、一部基底膜から剥がれた上皮細胞が内腔に浮いている像が見られた。　サイトカイン動態　正常に比べEAOでは脾臓におけるIL－1α，　IL－2，　IL－6，IL－10，　IFN一γ濃度は上昇した（図2）。また精巣内での RNAの発現量の上昇はIL－10，　IFN一γ，　TNF一αで認められた（図3）。　サイトカイン療法　抗IFN一γ抗体とrecombinant　IL－6を投与したところ疾患は抑制された。ところが、recombinant　IL－10を投与したところ疾患は逆に憎悪した。（8）一　90　一 東京医科大学雑誌 第64第1号図4Can　lymphocyte（L）gain　access　to　autoimmunogeneic　　antigens　of　testicular　germ　cells　at　the　tubuli　recti　（TR）　？　　M，　Macrophage．Cellular　lmrriunity　Humoral　lmrriunity麟　ゆ4？図5Achange　of　concept　of　relation　between　germ　cell（GC）　　autoantigrens　and　self　immune　system3．ま　と　め　今回、我々は同系精巣細胞の皮下注射のみによって誘導したEAOマウスの免疫学的微小環境を明らかにするため、正常およびEAOにおける直精細管とその周辺の微小構造変化並びに各種サイトカインについて調査した。正常の状態において直精細管の基底膜を越えてにマクロファージやリンパ球が存在し、EAOにおいて直精細管周囲の間質にリンパ球が浸潤するだけで、その上皮細胞は変性することが分かった。また、IL－1α，　IL－2，　IL－6，　IL－10，　IFN一γ，　TNF一αがEAOの進展に大きく関わっていることが示唆された。　精巣においてリンパ球は正常の状態でマウスでも人間においても少なからず間質に存在している6・7）。またマウスでは多くのマクロファージが直精細管周囲の問質に存在する6）。しかし、直精細管の基底膜を越えて内腔側に存在するマクロファージやリンパ球を明確に認める報告は今までなかった。（このような所見は精細管には一切見られなかった。）この所見より、図61mmunological　tissue　microcircumstance　leading　to　the　　spermatogenic　disturbance　during　EAO．　ST，　seminifer－　　ous　tubules．　TR，　tubuli　recti．精細管で形成された精子が、直精細管、そして精巣網へと運ばれる過程で分解・処理され、その精子自己抗原が、BTBの脆弱な部分を通り抜けて出精細管の周囲の間質に漏れでたり、精子を貧食した直話細管上皮細胞がその自己抗原を基底膜側へ一・部排出している可能性が考えられる（図4）。また、EAOにおいても直訳細管はリンパ球が最初に浸潤する場所であることより、何らかの機序でBTB外へ漏れ出た精子抗原を効率的に捕らえて感作されたTリンパ球に抗原提示できる微小環境がそこに作り出されている可能性があるといえる。　これらのことから、従来は精子抗原が免疫系から精巣血液関門にて完全に隔絶されていると認識されてきたが、生理的な脆弱な場である直精細管を通じて、精子抗原が免疫系に認識されていると推察した（図5）o　精巣において生理的に局所で分泌されるサイトカインが数多く報告されているが8）、今回の結果からEAO発症の過程には、さまざまなサイトカインが複雑にかかわり合っている可能性があることが分かった。なかでもIFN一γはその多面的作用を通じて免疫調節と炎症反応に深く関与している可能性がある。IFN一γにより活性化されたマクロファージから放出されるTNF一α、　IL－1αなどが直接、細胞障害をもたらしているかもしれない。またIL－6やIL－10の増加も認められTh　1だけでなくTh2の免疫応答も疾患の進展または憎悪には関わっていると考えられる。　我々が開発したEAOモデルはCD4＋T細胞（Thl）優位の免疫応答が深く関係する臓器特異的な自己免疫疾患であるが、TGC感作で刺激を受けた（9）2006年1月 第156回医学会総会演題抄録 一　91　一CD4＋T細胞が直精細管にて再び精子抗原の提示を受けて活性化すると、CD4＋T細胞だけでなくCD8＋T細胞、B細胞、マクロファージ、多核白血球などの炎症細胞が局所に動員され、各種サイトカインの働きにより炎症がさらに増強されると推察する。しかしその詳しいメカニズムは未だ分かっておらず、今後の解析が待たれる（図6）。2．腫瘍浸潤リンパ球によるヒト自然発生癌で　　の免疫反応評価（病理学講座）○佐藤　永一キーワード：腫瘍浸潤リンパ球、卵巣癌、生存率解　　　　　　析文 献1）　Ichisohasama　R，　Hirokawa　K，　Hatakeyama　S：Sper－　matogenic　disturbance　induced　in　mice　by　combined　local　injection　of　monoclonal　antibodies　to　Sertoli　cell　and　to　basal　lamina　of　seminiferous　tubule．　Am　J　Reprod　lmmunol　10（4）：　158－165，　19862）　Yule　TD，　Montoya　GD，　Russell　LD，　Williams　TM，　Tung　KS：　Autoantigenic　germ　cells　exist　outside　the　blood－testis　barrier．　J　Immunol　141（4）：　1161－1167，　　19883）　Tung　PS，　Fritz　IR：　Histopathological　changes　in　testes　of　adult　inbred　rats　immunized　against　pa－　chytene　spermatocytes　or　Sertoli　cells．　lnt　J　Androl　2：　459－481，　19874）　ltoh　M，　Hiramine　C，　Hojo　K：Anew　murine　model　of　autoimmune　orchitis　induced　by　immunization　with　viable　syngeneic　testicular　germ　cells　alone．　1．　Immunological　and　histological　studies．　Clin　Exp　Immunol　83（1）：　137－142，　19915）　ltoh　M，　Mukasa　A，　Tokunaga　Y，　Hiramine　C，　Hojo　K：　New　experimental　model　for　adoptive　transfer　of　murine　autoimmune　orchitis．　Andrologia　23：415－　420，　19916）El－Demiry　MI，　Hargreave　TB，　Busuttil　A，　James　K，　Ritchie　AW，　Chisholm　GD．　Lymphocyte　sub－　populations　in　the　male　genital　tract．　Br　J　Urol　57（6）：　769－74，　19857）　ltoh　M，　Hiramine　C，　Tokunaga　Y，　Mukasa　A，　Hojo　K：　A　new　murine　model　of　autoimmune　orchitis　induced　by　immunizaiton　with　viable　syngeneic　tes－　ticular　germ　cells　alone．　II．　immunohistological　findings　of　fully－developed　lesion．　Autoimmunity　10（2）：　89－97，　19918）伊藤正裕：「精巣機能とサイトカイン」Hormone　　Frontier　in　Gynecology．（メディカルレビュー社）　10（1）：　51－57，　2001要 旨　【背景】上皮性卵巣癌の局所（原発巣）でのCD3陽性Tリンパ球浸潤は患者の長期予後に相関する［Zhang　et　al．　NEJM　2004］［材料・方法］上皮性卵巣癌l17例のホルマリン固定パラフィン包埋検体を用いた。原発巣でのT細胞浸潤は、CD3、　CD4、　CD8をマーカーとして免疫組織化学的に検出した。高倍率視野で浸潤リンパ球を計測して定量化した。RegulatoryT細胞（Treg）はCD25／FOXP3の二重陽性で定義した。浸潤の多寡と予後との相関を、Log　rank　test、　Cox比例ハザードモデルで検討した。［結果・結論］T細胞浸潤は癌間質、癌胞巣内に見られた。癌胞巣内に浸潤するCD8陽性T細胞の多寡が患者の予後と相関しており、CD3陽性T細胞、　CD4陽性T細胞については予後と相関しなかった。B細胞浸潤と患者予後の相関は確認されなかった。また問質に浸潤するT細胞についてはCD8陽性T細胞も含めて、患者予後に影響を与えなかった。Tregの多寡は患者予後と相関しなかったが、癌胞巣内でのCD8／Treg比が予後と相関していた。すなわちTregがCD8陽性T細胞の抗腫瘍効果を抑制していると考えられた。癌局所に浸潤するT細胞の意義を評価するには、Tregも含む各種のリンパ球サブタイプを考慮して、包括的に評価する必要がある。免疫組織化学的手法で局所の免疫反応を評価することが可能であり、癌ワクチン臨床試験での免疫反応モニタリングなど、臨床への応用性、有用性が示された。はじめに　ヒト自然発生癌の局所に免疫反応が見られることは従来認識されている。1986年、Jassにより直腸癌では原発巣にリンパ球浸潤が目立つ症例の予後が良好であることが報告された1）。その後モノクロナル抗体作成、免疫組織化学の技術の発展により、各種の免疫担当細胞マーカーを用いた免疫反応の評価が可能と（　10　）

同系精巣細胞の皮下注射のみによって誘導するマウス実験的アレルギー性精巣炎の微小組織環境＜アレルギー疾患の診断と集学的治療＞

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同系精巣細胞の皮下注射のみによって誘導するマウス実験的アレルギー性精巣炎の微小組織環境＜アレルギー疾患の診断と集学的治療＞

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