Doutoramento em BioquímicaA maioria das funções celulares, incluindo expressão de genes, crescimento e
proliferação celulares, metabolismo, morfologia, motilidade, comunicação intercelular e
apoptose, é regulada por interações proteína-proteína (IPP). A célula responde a uma
variedade de estímulos, como tal a expressão de proteínas é um processo dinâmico e
os complexos formados são constituídos transitoriamente mudando de acordo com o
seu ciclo funcional, adicionalmente, muitas proteínas são expressas de uma forma
dependente do tipo de célula.
Em qualquer instante a célula pode conter cerca de centenas de milhares de IPPs
binárias, e encontrar os companheiros de interação de uma proteína é um meio de
inferir a sua função. Alterações em redes de IPP podem também fornecer informações
acerca de mecanismos de doença. O método de identificação binário mais
frequentemente usado é o sistema Dois Hibrido de Levedura, adaptado para rastreio
em larga escala. Esta metodologia foi aqui usada para identificar os interactomas
específicos de isoforma da Proteína Fosfatase 1 (PP1), em cérebro humano. A PP1 é
uma proteína fosfatase de Ser/Thr envolvida numa grande variedade de vias e eventos
celulares. É uma proteína conservada codificada por três genes, que originam as
isoformas α, β, e γ, com a última a originar γ1 e γ2 por splicing alternativo. As diferentes
isoformas da PP1 são reguladas pelos companheiros de interação – proteínas que
interagem com a PP1 (PIPs). A natureza modular dos complexos da PP1, bem como a
sua associação combinacional, gera um largo reportório de complexos reguladores e
papéis em circuitos de sinalização celular.
Os interactomas da PP1 específicos de isofoma, em cérebro, foram aqui descritos, com
um total de 263 interações identificadas e integradas com os dados recolhidos de várias
bases de dados de IPPs. Adicionalmente, duas PIPs foram selecionadas para uma
caracterização mais aprofundada da interação: Taperina e Sinfilina-1A.
A Taperina é uma proteína ainda pouco descrita, descoberta recentemente como sendo
uma PIP. A sua interação com as diferentes isoformas da PP1 e localização celulares
foram analisadas. Foi descoberto que a Taperina é clivada e que está presente no
citoplasma, membrana e núcleo e que aumenta os níveis de PP1, em células HeLa. Na
membrana ela co-localiza com a PP1 e a actina e uma forma mutada da Taperina, no
motivo de ligação à PP1, está enriquecida no núcleo, juntamente com a actina. Mais, foi
descoberto que a Taperina é expressa em testículo e localiza-se na região acrossómica
da cabeça do espermatozoide, uma estrutura onde a PP1 e a actina estão também
presentes.
A Sinfilina-1A, uma isoforma da Sinfilina-1, é uma proteína com tendência para agregar
e tóxica, envolvida na doença de Parkinson. Foi mostrado que a Sinfilina-1A liga às
isoformas da PP1, por co-transformação em levedura, e que mutação do seu motivo de
ligação à PP1 diminuiu significativamente a interação, num ensaio de overlay. Quando
sobre-expressa em células Cos-7, a Sinfilina-1A formou corpos de inclusão onde a PP1
estava presente, no entanto a forma mutada da Sinfilina-1A também foi capaz de
agregar, indicando que a formação de inclusões não foi dependente de ligação à PP1.
Este trabalho dá uma nova perspetiva dos interactomas da PP1, incluindo a
identificação de dezenas de companheiros de ligação específicos de isoforma, e
enfatiza a importância das PIPs, não apenas na compreensão das funções celulares da
PP1 mas também, como alvos de intervenção terapêutica.Most of the crucial functions in the cell, including gene expression, cell growth and
proliferation, metabolism, morphology, motility, intercellular communication and
apoptosis, are regulated by protein-protein interactions (PPIs). Cells respond to a variety
of stimuli, thus protein expression is a dynamic process and the complexes formed are
transiently assembled and change during their functional cycle; additionally, many
proteins are expressed in a cell type-dependent manner.
At any time, cell may contain about hundreds of thousands of binary PPIs, and finding
interaction partners of a certain protein it’s a mean of discovering its function. Changes
in PPIs networks may also provide information about disease mechanisms. The most
frequently used binary identification method is the Yeast Two Hybrid system, adapted to
high-throughput screening. This approach was here used in order to identify the Protein
Phosphatase 1 (PP1) isoform specific interactomes, in the human brain. PP1 is a
Ser/Thr protein phosphatase involved in a large variety of cellular pathways and events.
It is a conserved protein codified by three genes giving rise to the α, β and γ isoforms,
with the last originating γ1 and γ2 by alternative splicing. PP1 isoforms are regulated by
the binding partners – PP1 interacting proteins (PIPs). The modular nature of the PP1
complexes, as well as their combinational assembly, generates a large repertoire of
regulatory complexes and roles in signaling circuits.
The human brain isoform specific interactomes of PP1 were here described, with a total
of 263 interactions identified and integrated with the data collected from several PPIs
databases. Also, two PIPs were selected for further characterization of the interaction:
Taperin and Synphilin-1A.
Taperin is a poorly described protein, recently found to be a PIP. Its interaction with PP1
different isoforms and localization in the cell was analyzed. Taperin was found to be
cleaved and to be present in the cytoplasm, membrane and nucleus and to increase the
levels of PP1, in HeLa cells. In the membrane it co-localizes with PP1 and actin and a
mutant form of Taperin, in the PP1 binding motif, is enrich in the nucleus together with
actin. Moreover, Taperin was found to be expressed in testis and to localize in the
acrossome region of the sperm head, a structure where PP1 and actin are also present.
Synphilin-1A, an isoform of Synphilin-1, is an aggregation prone and toxic protein
involved in Parkinson`s Disease. Synphilin-1A was shown to bind PP1 isoforms, by
yeast co-transformation, and mutation of its PP1 binding motif decrease significantly the
interaction in an overlay assay. When overexpressed in Cos-7 cells, synphilin-1A formed
inclusion bodies where PP1 was present, but the mutated form of Synphilin-1A was also
able to aggregate indicating that inclusions formation was not dependent on PP1
binding.
This work gives a new perspective of PP1 interactomes, including the identification of
dozens of isoform specific binding partners, and emphasizes the importance of PIPs, not
only in the understanding of PP1 physiological functions but also, as targets for
therapeutic interventions
