Enzyme xylanase (endo-β-1,4-xylanase, EC 3.2.1.8) là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân các liên kết β-1,4-D-xylopyranose trong xylan.  Gene xylanase và vùng mã hóa gene xylanase (cds) của nấm mốc Aspergillus niger C1 được gắn vào vector biểu hiện pRSET A. Vector pRSET A-xylanase tái tổ hợp được tách dòng trong E. coli TOP10, biểu hiện trong E. coli BL21. Gene xylanase từ  A. niger C1 gồm 746 nucleotit trong đó có 1 intron ở vị trí 278-347, trình tự gene có 98 % độ tương đồng với gene mã hóa xylanase EU42881.1. Gene này được mã hóa bởi 225 axit amin và được gắn peptide tín hiệu gồm 37 axit amin có khối lượng phân tử là 30 kDa. Protein dung hợp được tổng hợp khi bổ sung 0,5 mM IPTG, định tính bằng điện di SDS – PAGE có trọng lượng phân tử là 30 kDa. Dich enzyme xylanase thô có hoạt độ 381,0 U/ml

Liên Hà, Trần

Thị Ngọc Ngà, Nguyễn

Vietnam Academy of Science and Technology: Journals Online

  
Tạp chí Khoa học và Công nghệ 51 (1) (2013) 73-79 
 
TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GENE MÃ HÓA ENZYME  
XYLANASE TỪ NẤM MỐC Aspergillus niger C1 VÀO E. coli BL21 
Trần Liên Hà*, Nguyễn Thị Ngọc Ngà 
Viện Công nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm 
Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, 1 Đại Cồ Việt, Hà Nội 
*Email: tranlienha@yahoo.com 
Đến Tòa soạn: 20/8/2011; Chấp nhận đăng: 15/11/2012 
TÓM TẮT 
Enzyme xylanase (endo-β-1,4-xylanase, EC 3.2.1.8) là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân 
các liên kết β-1,4-D-xylopyranose trong xylan.  Gene xylanase và vùng mã hóa gene xylanase 
(cds) của nấm mốc Aspergillus niger C1 được gắn vào vector biểu hiện pRSET A. Vector 
pRSET A-xylanase tái tổ hợp được tách dòng trong E. coli TOP10, biểu hiện trong E. coli BL21. 
Gene xylanase từ  A. niger C1 gồm 746 nucleotit trong đó có 1 intron ở vị trí 278-347, trình tự 
gene có 98 % độ tương đồng với gene mã hóa xylanase EU42881.1. Gene này được mã hóa bởi 
225 axit amin và được gắn peptide tín hiệu gồm 37 axit amin có khối lượng phân tử là 30 kDa. 
Protein dung hợp được tổng hợp khi bổ sung 0,5 mM IPTG, định tính bằng điện di SDS – PAGE 
có trọng lượng phân tử là 30 kDa. Dich enzyme xylanase thô có hoạt độ 381,0 U/ml. 
Từ khóa: xylanase, Aspergillus niger, gene xylanase.  
1. MỞ ĐẦU 
Xylan, một trong những thành phần cơ bản của hemicellulose, là polysaccharide chiếm tỉ lệ 
lớn thứ hai sau cellulose ở thành tế bào thực vật, tồn tại ở dạng liên kết hoặc không liên kết với 
cellulose, lignin, pectin hay những polysaccharide khác để duy trì tính nguyên trạng của thành tế 
bào [1]. Xylan là một hỗn hợp có chứa các nhóm phụ là các gốc acetyl, 4-O-methyl-D-
glucuronosyl và α-arabinofuranosyl liên kết với bộ khung được tạo bởi các gốc xylopyranose. 
Bộ khung này được liên kết với nhau theo kiểu β-1,4-glycozide [2]. Để thủy phân hoàn toàn 
xylan cần có sự kết hợp của một hệ thống các enzyme. Trong số đó, enzyme quan trọng nhất là 
enzyme endo-xylanase (endo-β-1,4-xylanase), xúc tác phản ứng  thủy phân các liên kết β-1,4-D-
xylopyranose trong xylan [3, 4]. Enzyme xylanase được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ sản 
xuất thức ăn gia súc, công nghệ thực phẩm, sản xuất giấy, sản xuất cồn nhiên liệu…. [4, 5, 6]. 
Với mong muốn nghiên cứu đặc điểm của gene xylanase ở A. niger cũng như mong muốn 
sản xuất xylanase với năng suất cao hơn, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tách dòng, 
biểu hiện gene mã hóa enzyme xylanase từ nấm mốc Aspergillus niger C1 vào E. coli 
BL21”. 
 
  
Trần Liên Hà, Nguyễn Thị Ngọc Ngà 
 74
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 
2.1. Chủng vi sinh vật và plasmit 
Chủng giống Aspergillus niger C1 trong bộ sưu tập giống, Viện Công nghệ Sinh học – 
Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội [9]. 
Chủng E. coli TOP10, chủng  E. coli BL21và plasmid pRSET A (Invitrogen).  
2.2. Hóa chất  
4 loại deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP), MgCl2 và Ex-Taq polymerase 
(Fermentas), primer được tổng hợp từ công ty Sigma. 
Bộ Kit của invitrogen được sử dụng để tách chiết DNA plasmid.  
Tris base, ethylene diamine- tetra- acetic acid (EDTA), CTAB, NaCl, NaH2PO4, NaCl, 
imidazole, DTT, Triston – X100, Co-IP (protease inhibitor), hạt Coban, SiO4, NaI, 
isopropanol… (Sigma). 
2.3. Môi trường 
- Môi trường Czapek (g/l): saccharose 30, cao nấm men 5, NaNO3 3, KH2PO4 1, MgSO4. 
7H2O 0,5, KCL  0,01. 
- Môi trường LB (g/l): cao nấm men 5, trypton 10, NaCl  10, agar 15. 
2.4. Phương pháp tách chiết DNA tổng số 
Một lượng 0,2 gam sinh khối nấm mốc sau khi nuôi 48 giờ cho vào 1 ml đệm lysis (100 
mM Tris-HCl pH 8, 10 mM EDTA, 2 % SDS, 1 % β-mecaptoethanol, 100 µg protease K) rồi ủ ở 
65 oC trong 1 giờ. Sau đó bổ sung NaCl 5 M để đạt nồng độ NaCl là 0,7 M và CTAB 10 % với 
thể tích bằng 1/10 dịch, ủ ở 65 oC trong 30 phút. Hỗn hợp Clorofom:Isoamyl alcohol (24 : 1) cho 
vào dịch với tỉ lệ 1 : 1, li tâm ở 13000 vòng/ phút trong 10 phút và thu dịch nổi. Tiếp đó,  
isopropanol được cho vào với tỉ lệ 1 : 1, li tâm ở 13000 vòng/phút trong 30 phút, thu kết tủa. Kết 
tủa được rửa bằng ethanol 70%, li tâm ở 13000 rpm/ 10 phút. Làm khô kết tủa và hòa tan trong 
50 µl TE (10 mM Tris, 1mM EDTA). 
2.5. Phương pháp khuếch đại gene bằng phản ứng overlap PCR 
Từ phân tích các trình tự gene xylanase trên dữ liệu của ngân hàng gene cặp mồi F1 và F2 
được thiết kế để nhân gen mã hóa cho enzyme xylanaze. Kết quả thu được so sánh với trình tự 
gene xylanaze trên ngân hàng gene thế giới bằng chương trình BLAST của cơ sở dữ liệu NCBI, 
xác định được gene xylanase  có một intron nằm giữa hai exon. Để biểu hiện gene xylanase từ 
nấm mốc A. niger C1 vào E. coli cần loại bỏ được đoạn intron bằng phương pháp overlap PCR. 
Sử dụng hai cặp mồi F1R1 và F2R2 để khuếch đại hai đoạn exon riêng rẽ. Sau đó, sản phẩm 
phản ứng PCR với cặp mồi F1R1 và F2R2 sẽ được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp 
mồi F1R2. 
Mồi F1 và mồi R2 được gắn đoạn nucleotide là vị trí cắt của enzyme cắt giới hạn Xho I và 
Nco I để chèn vào vector tách dòng và biểu hiện pRSET A:  
 
  
Tách dòng và biểu hiện gene mã hóa enzyme  xylanase từ nấm mốc Aspergillus niger C1 ... 
 75
F1 : 5’- GCCTCGAGATGCTCACCAAGAACCT- 3’ 
                      Xho I 
R1 : 5’- CATTGTCCTGCGCACTTCCGGGGT- 3’ 
F2 : 5’ -TTCATGGTGCGCAGGACATCACCTA- 3’ 
R2 : 5’- GCCCATGGTTACTGAACAGTGATGG- 3’ 
                  Nco I 
2.6. Phương pháp tách dòng và biểu hiện gene xylanase 
Sản phẩm của PCR và overlap PCR và vector pRSET A được cắt bằng với hai enzyme giới 
hạn Xho I và Nco I; nối vòng bằng enzyme T4 ligase tạo vector tái tổ hợp. Vector tái tổ hợp được 
biến nạp vào tế bào E. coli TOP 10 bằng phương pháp sốc nhiệt. Tế bào sau đó được cấy trang 
trên mặt thạch có bổ sung Ampicillin với tỉ lệ 50 µg/µl, nuôi qua đêm ở 37 oC. Lấy 1 khuẩn lạc 
riêng rẽ nuôi trong ống nghiệm chứa 5 ml môi trường LB lỏng có bổ sung Ampicillin với tỉ lệ              
50 µg/µl, nuôi lắc 200 vòng/ phút qua đêm ở 37 oC rồi tách plasmit để giải trình tự gene.  
Lấy 5 ml canh trường khuẩn lạc chứa vetor và cds xylanaza chuyển sang bình 2 lít có chứa 
400 ml môi trường LB lỏng, bổ sung ampicillin với tỉ lệ 50 µg/µl, nuôi lắc 200 vòng/ phút ở             
37 oC trong khoảng từ 3 giờ – 5 giờ (tới khi OD600nm = 0,6). Bổ sung IPTG cho tới nồng độ IPTG 
đạt 0,5 mM, nuôi lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ 22 oC qua đêm trong thời gian 8 giờ. 
2.7. Định tính bằng SDS – PAGE 
Lấy 10 µg dich lên men được trộn đều với đệm mẫu protein 5X (12 mM Tris-HC; 5 % 
glycerol; 0,4 % SDS; 2,8 mM 2-mercaptoethanol; 0,2 % bromophenol blue), đun sôi trong thời 
gian 10 phút. Điện di trên gel polyacrylamide 10 % nhuộm bản gel bằng thuốc nhuộm coomassie 
blue. 
2.8. Xác định hoạt độ enzyme bằng phản ứng DNS 
 Sử dụng enzyme xylanase phản ứng với cơ chất xylan 1 % pha trong đệm citrate pH = 5,3. 
Phản ứng enzyme được tiến hành ở 5 0oC trong 5 phút. 
“Một đơn vị hoạt độ của enzyme xylanase được định nghĩa là lượng enzyme có khả năng 
thủy phân xylan tạo 1 µmol xylose trong thời gian 1 phút”. 
3. KẾT QUẢ 
3.1. Phản ứng khuếch đại gene và vùng mã hóa enzyme xylanase 
Hình 1 cho thấy các kết quả chạy PCR khuếch đại gene và vùng mã hóa enzyme xylanase.  
Gene mã hóa enzyme xylanaza có độ dài 700 bp - 800 bp. Kết quả điện di cho thấy vạch khuếch 
đại đoạn exon 1 có kích thước khoảng 300 bp và đoạn exon 2 có kích thước khoảng 400 bp   
(hình 1B). Sau khi khuếch đại thành công hai đoạn exon một và exon hai, thu cds của gene 
xylanase bằng phản ứng overlap PCR. Phản ứng overlap PCR với cặp mồi F1R2 sử dụng sản 
phẩm của phản ứng PCR khuếch đại hai đoạn exon riêng lẻ làm DNA khuôn thu được sản phẩm 
có độ dài 600 bp - 700 bp (hình 1C). Sản phẩm tinh sạch cds xylanase bằng bộ kit MINELUTE 
được sử dụng để gắn vào vector pRSET A và tách dòng trong E. coli TOP10 (hình 1C2). 
  
Trần Liên Hà, Nguyễn Thị Ngọc Ngà 
 76
 
M      1        M      2     3   M      1      4 
                  
 
 
  A        B      C 
   
Hình 1. Điện di đồ sản phẩm PCR và overlap PCR khuếch đại gene xylanase và                       
cds xylanase của nấm mốc A. C1. 
M: thang DNA chuẩn 100 bp; A: Điện di đồ sản phẩm của PCR khuếch đại gene mã hóa xylanase; 
B: Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại 2 exon của gene xylanase; 
C:  Điện di đồ tinh sạch  sản phẩm  overlap PCR khuếch đại cds của gene xylanase                                              
(1: sản phẩm overlap PCR; 2: sản phẩm overlap PCR sau tinh sạch). 
3.2. Tách dòng gene xylanase trong E. coli TOP10 
Sản phẩm phản ứng PCR khuếch đại gene xylanaza và cds gene xylanase được đưa vào 
vector pRSET A và biến nạp vào trong tế bào chủ E. coli TOP10 (hình 2). Tiến hành tách 
plasmit tái tổ hợp và giải trình tự gene xylanaza và cds xylanaza.  
 
Hình 2. Kết quả biến nạp pRSET A gắn cds xylanase vào E. coli TOP10. 
Kết quả giải trình tự gene xylanaza và cds gene xylanase cho ta thấy gene xylanaza có độ 
dài 746 bp và cds xylanaza 68 bp và 1 intron ở vị trí 278-347 (hình 3). Kiểm tra độ tương đồng 
cds gene xylanase của nấm mốc A. niger C1 và cds gene xylanase B (xynB) của nấm mốc 
500bp
bp 
700bp
 
300bp
bp 
500bp 
500bp
bp 
700bp
 
  
Tách dòng và biểu hiện gene mã hóa enzyme  xylanase từ nấm mốc Aspergillus niger C1 ... 
 77
Aspergillus niger ( mã số EU423881.1.) bằng chương trình BLAST của cơ sở dữ liệu NCBI cho 
thấy độ tương đồng đạt 98 %.  
Kết quả phân tích ở trên khẳng định rằng đã tách dòng thành công gene xylanaza và cds 
gene mã hóa xylanase từ chủng nấm mốc A. niger C1 vào E. coli TOP10.  
ATGCTCACCAAGAACCTTCTCCTCTACTTCGCCGCGGCTAAGGCTGCTCTGGCTGTTCCC   
CACGACTCTGTCGCCCAGCGTTCGGATGCCTTGCACATGCTCTCTGAGCGCTCGACCCCG   
AGCTCGACCGGCGAGGACAACGGCTTCTACTACTCCTTCTGGACCGACGGCGGTGGCGAC   
GTGACCTACACCAACGGAGATGCTGGTGCCTACACTGTTGAGTGGTCCAACGTGAGCAAC   
TTTGTCGGTGGAAAGGGCTGGAACCCCGGAGGTGCGCAgtaagttaatcatcctcacact 
Atctctttaaaggatccaataaaacgattactcacatcatctccagg GGACATCACCTA 
CAGCGGCACCTTCACCCCTAGCGGCAACGGCTATCTCTCCGTCTATGGCTGGACCACCGA 
CCCCCTGATCGAGTACTACATCGTCGAGTCCTACGGCGACTACAACCCCGGCAGTGGAGG 
CACATACAAGGGCACCGTCACCTCGGACGGATCCGTTTACGATATCTACACGGCTACCCG 
TACCAATGCTGCTTCCATTCAGGGAACCGCTACCTTCACTCAGTACTGGTCCGTCCGCCA 
GAACAAGAGAGTTGGCGGAACTGTTACCACCTCCAACCACTTCAATGCTTGGGCTAAGCT 
GGGAATGAACCTGGGTACTCACAACTACCAGATCGTGGCTACCGAGGGTTACCAGAGCAG 
TGGATCTTGGCCCATCACTGTTCAGTAA   
Hình 3. Trình tự gene mã hóa enzyme xylanase của nấm mốc A. niger C1 
(Chữ in nghiêng là trình tự intron). 
3.3. Biểu hiện gene mã hóa xylanase trong E. coli BL21 
Vector pRSET A có chứa cds xylanase được biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt vào               
E. coli BL21, nuôi trong môi trường LB lỏng bổ sung ampicillin với chất cảm ứng là IPTG. Thu 
enzyme thô bằng phương pháp siêu âm phá tế bào. Protein tống số được điện di kiểm tra gel 
polyacrylamide 10 % (hình 4). Kết quả cho thấy dịch enzyme thô có 1 band đậm có kích thước 
khoảng 30 kDa và có hoạt độ đạt 381 U/ml. Từ kết quả giải trình tự cho thấy enzyme xylanase 
của nấm mốc Aspergillus niger C1 có 226 amino acid, được gắn thêm peptide tín hiệu gồm            
37 amino acid của vector pRSET A có trọng lượng khoảng 30 kDa. Do vậy band có kích thước 
30 kDa là band của enzyme xylanase. 
 
Hình 4. Điện di đồ protein tổng số trên PAGE. 
M : Protein marker (kDa) 
Xylanase : Dịch enzyme xylanase thô 
 
30 kDa 
  
Trần Liên Hà, Nguyễn Thị Ngọc Ngà 
 78
Hoạt độ enzyme xylanase tái tổ hợp từ nấm mốc A. niger C1 biểu hiện trong E. coli BL21 
đạt 381 U/ml cao hơn hoạt độ enzyme xylanase tái tổ hợp từ A. usamii E001  [7] cũng được biểu 
hiện trong E. coli BL21 với vector biểu hiện pET-28a là 287 U/ml nhưng thấp hơn hoạt độ của 
enzyme xylanase từ Trichoderma reesei RutC-30 [8] là 560 U/ml. Cùng hệ thống vật chủ biểu 
hiện, nhưng đối với những gene xylanase từ những chủng nấm mốc khác nhau, sử dụng vector 
biểu hiện khác nhau, điều kiện nuôi thu và tinh sạch enzyme khác nhau sẽ thu được những 
enzyme có hoạt tính khác nhau.  
4. KẾT LUẬN 
Tách dòng thành công gene xylanase từ A. niger vào  E. coli TOP10. Gene có kích thước 
746 bp chứa 1 intron ở vị trí 278 - 347. Biểu hiện thành công cds gene xylanase kích thước               
668 bp vào E. coli BL21 với dịch enzyme thô có hoạt độ 381U/ml, kiểm tra sự biểu hiện bằng 
điện di SDS – PAGE phát hiện protein có trọng lượng phân tử 30 kDa.   
Lời cảm ơn. Các tác giả chân thành cám ơn GS.TS. Hwang Inhwan khoa khoa học và đời sống Trường 
Đại học Công nghệ Pohang giúp đỡ để thực hiện một số thí nghiệm trên. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
1. Biely P. - Microbial xylanolytic systems, Trends in Biotechnol. 3 (1985) 286-289. 
2. Bissoon  S.,  Christov  L.,  and  Singh  S. -  Bleach  boosting  effects  of  purified  xylanase  
from Thermomyces lanuginosus SSBP on bagasse pulp, Process Biochem. 37 (2002)             
567-572.  
3. Chenyan Zhou, Jianyu Bai, Shanshan Deng, Jin Wang, Jie Zhub, Minchen Wu, Wu Wang 
- Cloning of a xylanase gene from Aspergillus usamii and its expression in Escherichia 
coli, Bioresource Technology 99 (2008) 831-838. 
4. Polizeli M. L., Rizzatti A. C., Monti R., Terenzi H. F., Jorge J. A., Amorim D. S. -  
Xylanase from fungi: properties and industrial application, Appli. Microbiol. Biotechnol. 
67 (2005) 577-591. 
5. Kansoh A. L. - Xylanase and mannanase from Streptomyces gallbus NR and their use in 
biobleaching of softwood kraft pulp, Antonie Van Leeuwenhoek  J. Gen. Mol. Microbiol. 
85 (2004) 103-110. 
6. Wong  K. K. Y., Tan L. U. L., and Saddler, J. N. - Multiplicity   of   β-1,4-xylanase in 
microorganisms: Functions and applications, Microbiol. Rev. 52 (1988) 305-317. 
7. Chenyan Zhou, Jianyu Bai, Shanshan Deng, Jin Wang, Jie Zhu, Minchen Wu, Wu Wang - 
Cloning of a xylanase gene from Aspergillus usamii and its expression in Escherichia coli, 
Bioresource Techonology 99 (2008) 831-838. 
8. HeJun, YuBing, ZhangKeying, DingXuemei, ChenDaiwen - Expression of a Trichoderma 
reesei β-xylanase gene in Escherichia coli and activity of the enzyme on fiber-bound 
substrates Protein expressionandpurification 67 (2009) 1–6. 
9. Trần Liên Hà, Nguyễn Thương Thương, Nguyễn Thành Chung, Nguyễn Văn Cách - Phân 
lập và tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh enzyme xylanase cao và một số đặc 
tính của chủng, Tạp chí Sinh học 8 (2010) 879-884.  
  
Tách dòng và biểu hiện gene mã hóa enzyme  xylanase từ nấm mốc Aspergillus niger C1 ... 
 79
ABSTRACT 
CLONING AND EXPESSION XYLANASE GENE OF Aspergillus niger C1 IN E. coli BL21 
Tran Lien Ha*, Nguyen Thi Ngoc Nga 
School of Biotechnology - Food Technology, Hanoi University of Science and Technology 
*Email: tranlienha@yahoo.com 
Enzyme xylanase (endo-β-1,4-xylanase, EC 3.2.1.8) is a catalytic enzyme of  β-1,4-D-
xylopyranose hydrolysis in xylan. Xylanase gene and coding region of xylanase gene (cds) of 
Aspergillus niger C1 were inserted in expression pRSET A vector. For cloning gene and 
expression gene E. coli TOP10 and E. coli BL21 were used, respectively.  Xylanase gene of  A. 
niger C1 has 746 nucleotide, in which one intron is from 278 - 347. The gene sequence has 98 % 
homology with xylanase gene EU42881.1. The gene encodes for 225 amino acid and with signal 
peptide of 37 amino acid they have molecular weight of 30 kDa. The fermentation has xylanase 
activity of 381.0 U/ml. 
Keywords: xylanase, Aspergillus niger, gene xylanase. 
 
 


TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GENE MÃ HÓA ENZYME  XYLANASE TỪ NẤM MỐC Aspergillus niger C1 VÀO E. coli BL21

http://vjs.ac.vn/index.php/jst/article/download/9563/7866

TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GENE MÃ HÓA ENZYME XYLANASE TỪ NẤM MỐC Aspergillus niger C1 VÀO E. coli BL21

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Vietnam Academy of Science and Technology: Journals Online