O objetivo deste trabalho foi estudar a produção de queratinase por Aspergillus carbonarius URM 1546, tendo-se como substrato penas de galinha, por meio de planejamento fatorial completo 23. Todos os parâmetros estudados e as interações de segunda ordem foram estatisticamente significativos. A maior atividade queratinolítica (48,9 U mL-1) foi obtida com 120 rpm, 0,5% (p/v) de penas de galinha e sete dias de cultivo.The objective of this work was to evaluate the keratinase production by Aspergillus carbonarius URM 1546, using as substrate poultry feather in a full experimental design 23. The studied parameters and the second-order interactions were statistically significant. The maximum keratinase activity (48.9 U mL-1) was obtained using 120 rpm, with 0.5% (w/v) poultry feather and seven culture days

Cavalcanti, Maria Taciana Holanda

Filho, José Luiz de Lima

Motta, Cristina Maria de Souza

Porto, Ana Lúcia Figueiredo

Sales, Marilia Ribeiro

Embrapa: Sistema Eletrônico de Editoração de Revistas

Pesq. agropec. bras., Brasília, v.43, n.2, p.285-288, fev. 2008Utilização de penas de galinha para produção de queratinase 285Notas CientíficasUtilização de penas de galinha para produção de queratinasepor Aspergillus carbonariusMarilia Ribeiro Sales(1), Maria Taciana Holanda Cavalcanti(1), José Luiz de Lima Filho(1),Cristina Maria de Souza Motta(2) e Ana Lúcia Figueiredo Porto(3)(1)Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami, Cidade Universitária, CEP 50670-901 Recife, PE.E-mail: mariliarsales@gmail.com, mtcvsoares@yahoo.com.br, joseluiz60@gmail.com (2)UFPE, Centro de Ciências Biológicas, Departamentode Micologia, Coleção de Culturas URM, Campus Universitário, Cidade Universitária, CEP 50670-901 Recife, PE. E-mail: smotta@ufpe.br(3)Universidade Federal Rural de Pernambuco, Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, Rua Dom Manoel de Medeiros, s/no, Dois Irmãos,CEP 52171-900 Recife, PE. E-mail: anaporto@dmfa.ufrpe.brResumo – O objetivo deste trabalho foi estudar a produção de queratinase por Aspergillus carbonariusURM 1546, tendo-se como substrato penas de galinha, por meio de planejamento fatorial completo 23. Todos osparâmetros estudados e as interações de segunda ordem foram estatisticamente significativos. A maior atividadequeratinolítica (48,9 U mL-1) foi obtida com 120 rpm, 0,5% (p/v) de penas de galinha e sete dias de cultivo.Termos para indexação: enzimas queratinolíticas, fungos filamentosos, queratina.The use of poultry feather to produce keratinase by Aspergillus carbonariusAbstract – The objective of this work was to evaluate the keratinase production by Aspergillus carbonariusURM 1546, using as substrate poultry feather in a full experimental design 23. The studied parameters and thesecond-order interactions were statistically significant. The maximum keratinase activity (48.9 U mL-1) was obtainedusing 120 rpm, with 0.5% (w/v) poultry feather and seven culture days.Index terms: keratinolitic enzymes, filamentous fungi, keratin.A indústria avícola produz uma grande quantidade depenas com potencial para causar impacto ambiental, poisse acumulam em forma de lixo após o processamentodas aves para consumo humano (Onifade et al., 1998).No entanto, as penas possuem cerca de 87% de proteína(Bureau et al., 1999) em forma de queratina (Riffel et al.,2003).A queratina não é degradada por enzimas proteolíticascomuns, como tripsina e pepsina, por conter uma grandequantidade de pontes dissulfeto e de hidrogênio, einterações hidrofóbicas (Riffel et al., 2007). Esta proteínaé degradada por enzimas específicas, denominadasqueratinases, que são capazes de hidrolisar as ligaçõespeptídicas da queratina e são produzidas por diversosmicrorganismos e vegetais (Said & Pietro, 2004).Essas enzimas podem ser usadas para oprocessamento biotecnológico de penas ao se fazer suabioconversão de poluidores em potencial para ração ricaem nutrientes, pois possuem aminoácidos essenciaiscomo glicina e leucina, além de proporcionaremenriquecimento adicional da ração pela própria biomassamicrobiana (Said & Pietro, 2004).Para o desenvolvimento de produtos, a partir demicroganismos, é necessário o estudo dos fatores quepodem influenciar na produção da biomolécula deinteresse. O aperfeiçoamento da produção pode serrealizado por meio de planejamentos fatoriais para severificar os efeitos das variáveis independentes e estimaros efeitos das interações entre estas (interações desegunda ordem) sobre a variável resposta (Kalil et al.,2000).Em estudos preliminares, o isolado de Aspergilluscarbonarius URM 1546 apresentou-se como melhorprodutor de queratinase, entre outros isolados do gêneroAspergillus da Coleção de Culturas URM – UFPE, epor isso foi selecionado para o presente estudo (Saleset al., 2007).O objetivo deste trabalho foi estudar a produção dequeratinase por Aspergillus carbonarius URM 1546,tendo-se utilizado como substrato penas de galinha, porPesq. agropec. bras., Brasília, v.43, n.2, p.285-288, fev. 2008M.R. Sales et al.286meio de planejamento fatorial completo 23, em cultivolíquido submerso. As variáveis independentes foram:agitação, concentração de substrato e tempo de cultivo,e, a variável resposta foi a atividade queratinolítica.O experimento foi realizado no Laboratório deImunopatologia Keizo Asami – LIKA, da UniversidadeFederal de Pernambuco (UFPE), no primeiro semestrede 2007. O isolado de Aspergillus carbonarius,URM 1546, foi obtido na Coleção de Culturas URM(University Recife Mycology), do Departamento deMicologia da UFPE. As culturas foram mantidas em ágarSabouraund, modificado pela retirada do extrato delevedura e autoclavado por 20 min a 121ºC.A produção da enzima por fermentação submersa foirealizada de acordo com Friedrich et al. (1999),modificada pela utilização de penas de galinhas limpas edesengorduradas (Wawrzkiewicz et al., 1987), e o pHda solução tampão fosfato de sódio (0,3 M) utilizadofoi 7,8.O microrganismo foi cultivado em tubos deErlenmeyer, com capacidade para 250 mL, com 50 mLdo meio líquido para a produção da enzima (esterilizaçãopor autoclave, 20 min, 121ºC). Os ensaios comconcentração de 104 esporos por mL foram incubadosa 30ºC, em diferentes condições de agitação (120, 150 e180 rpm), tempos de cultivo (3, 5 e 7 dias) e concentraçãode penas de galinha (0,5, 1,0 e 1,5% p/v), para adeterminação dos melhores níveis dessas três variáveis.O erro-padrão foi calculado por meio da realização detrês repetições no ponto central.Para a determinação da atividade queratinolítica, foiutilizado o método descrito por Muhsin & Hadi (2001).Foram utilizados 500 µL do extrato enzimático, 50 mgde pena de galinha tratada e 5 mL de solução tampãofosfato de sódio (0,3 M, pH 7,2), colocados em tuboscônicos com capacidade para 14 mL; o conteúdo foimisturado por inversão e incubado a 37ºC durante 2 horasem banho-maria, com leve agitação constante. A reaçãofoi interrompida pela imersão dos tubos em banho degelo (10 min), e as amostras foram, então, centrifugadas(5.000 g). A absorbância das amostras foi mensuradapor espectrofotometria a 280 nm. Cada ensaio foirealizado em duplicata e foi feita uma amostra controle(enzima inativada por calor a 100ºC). Uma unidade daatividade enzimática foi determinada como aumento dovalor da absorbância de 0,01 a 280 nm, nas condiçõesexperimentais, e expressa em unidades por mililitro.Os dados obtidos foram analisados com o programaStatistica 7.Os resultados obtidos a partir do planejamentoestatístico completo 23 demonstraram que as melhorescondições para a produção de queratinase porA. carbonarius URM 1546 foram as do ensaio 5, nascondições: 120 rpm de agitação, 0,5% (p/v) deconcentração de substrato e sete dias de cultivo(Tabela 1). No diagrama de Pareto (Figura 1 A), épossível observar que as interações de segunda ordemforam mais importantes do que os efeitos principais decada variável testada. Entretanto, todos os parâmetrosanalisados foram significativos a 5% de probabilidade.O parâmetro que mais influenciou na produção dequeratinase por A. carbonarius URM 1546 foi a interaçãoentre a agitação e a concentração do substrato, que mostrouefeito positivo, o que indica relação diretamenteproporcional entre essas duas variáveis (Figura 1 A).Por meio dos resultados obtidos, pôde-se deduzir ográfico de superfície de resposta para as variáveis:atividade queratinolítica, tempo de cultivo e concentraçãode substrato (Figura 1 B); ademais, pôde-se estimarestatisticamente a equação que explica o comportamentoda produção da queratinase nessas variáveis: atividadequeratinolítica (U mL-1) = 6,3799 - 8,5425CS -2,4731dias, em que CS é a concentração de substrato(%, p/v); e dias representa o tempo de cultivo.O gráfico construído, a partir dos dados da atividadequeratinolítica e das variáveis concentração de substratoe agitação, está apresentado na Figura 1 C. A equaçãodo gráfico é: atividade queratinolítica (U mL-1) = 45,9767- 8,5425NA - 0,1818CS, em que NA é o nível da agitação(rpm); e CS é a concentração de substrato (%, p/v).Tabela 1. Matriz estatística do planejamento fatorial dos níveisdas variáveis experimentais (agitação, concentração desubstrato e tempo de cultivo), para produção de queratinase,com as respostas da atividade queratinolítica apósfermentação por Aspergillus carbonarius URM 1546, tendo-se utilizado pena de galinha como substrato.Pesq. agropec. bras., Brasília, v.43, n.2, p.285-288, fev. 2008Utilização de penas de galinha para produção de queratinase 287A atividade queratinolítica de 48,9 U mL-1, obtida a partirdo cultivo submerso de A. carbonarius URM 1546, tendo-se utilizado pena de galinha na determinação, mostrou-sesuperior àquela obtida por fungo do mesmo gênero, oA. flavus, o qual produziu 0,781 U mL-1 após sete dias decultivo submerso (Friedrich et al., 1999).Anbu et al. (2007) estudaram a produção de queratinasesvariando a concentração de penas como substrato de 0,2a 3,8% (p/v) e o tempo de produção de uma a novesemanas, entre outras variáveis, e obtiveram como melhorresultado para a atividade queratinolítica 6,2 U mL-1 empresença de 1,5% (p/v) de substrato, após cinco semanasde cultivo, com Scopulariopsis brevicaulis.Nestetrabalho, A. carbonarius URM 1546 foi mais eficiente naprodução de queratinase, com menor tempo de produçãoe maior atividade queratinolítica do que o microrganismoutilizado por Anbu et al. (2007).Ramnani & Gupta (2004) estudaram a produção dequeratinase a partir de Bacillus licheniformis RG1, emmeio com penas de galinha como substrato, e variaram acomposição do meio de cultivo. Eles obtiveram como melhorresultado a atividade queratinolítica de 1.295 U mg-1 dematéria seca, no meio com 0,5% de penas, em 72 horasde cultivo a 37ºC; estes resultados são semelhantes, emrelação à concentração de substrato, aos encontradospara a produção de queratinase por A. carbonariusURM 1546 .Neste trabalho, A. carbonarius URM 1546 demonstra-se eficiente na utilização de penas de galinha comosubstrato, para a produção de queratinase. Para se obtermaior atividade queratinolítica por A. carbonariusURM 1546, devem ser utilizados os menores níveis paraas variáveis agitação e concentração de substrato, bemcomo aumentar o tempo de cultivo, segundo os ensaiosrealizados.AgradecimentosAo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científicoe Tecnológico, pelo apoio financeiro; à Granja PintoFormoso (Carpina, PE), por ceder as penas de galinhausadas na pesquisa.ReferênciasANBU, P.; GOPINATH, S.C.B.; HILDA, A.; LAKSHMIPRIYA,T.; ANNADURAI, G. Optimization of extracellular keratinaseproduction by poultry farm isolate Scopulariopsis brevicaulis.Bioresource Technology, v.98, p.1298-1303, 2007.Figura 1. A) Diagrama de Pareto, relativo aos efeitos-padrãodas diferentes variáveis, testadas no experimento de produçãode queratinase por Aspergillus carbonarius URM 1546, queutilizou penas de galinha como substrato. As variáveis foram:agitação, concentração do substrato e tempo de cultivo.O ponto no qual os efeitos são estatisticamente significativos(p = 0,05) é indicado pela linha vertical tracejada. Erropuro = 0,02. B e C) Gráficos de superfícies em três dimensões.Em B as variáveis independentes foram tempo de cultivo econcentração de substrato. Em C as variáveis independentesforam concentração de substrato e agitação. Em ambos, avariável resposta foi atividade queratinolítica.BCAgitação (rpm)Atividadequeratinolítica(UmL)-1Atividadequeratinolítica(UmL)-1Concentração de substrato(%)Tempo de cultivo (dias)Ap=0,05Concentração de substrato (%)Pesq. agropec. bras., Brasília, v.43, n.2, p.285-288, fev. 2008M.R. Sales et al.288BUREAU, D.P.;  HARRIS, A.M.; CHO, C.Y. Apparentdigestibility of rendered animal protein ingredients for rainbowtrout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture, v.180, p.345-358,1999.FRIEDRICH, J.; GRADISAR, H.; MANDIN, D.; CHAUMONT,J.P. Screening fungi for synthesis of keratinolitic enzymes. Lettersin Applied Microbiology, v.28, p.127-130, 1999.KALIL, S.J.; MAUGERI, F.; RODRIGUES, M.I. Responsesurface analysis and simulation as a tool for bioprocess designand optimization. Process Biochemistry, v.35, p.539-550, 2000.MUHSIN, T.M.; HADI, R.B. Degradation of keratin substrates byfungi isolated from sewage sludge. 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